청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

요약

이 프로토콜의 목표는 쥐 모델에서 배측 달팽이관 핵에 직접 접근할 수 있도록 하는 수술적 접근 방식을 설명하는 것입니다.

초록

체포 또는 청력 손실을 반대하는 바이러스 매개 유전자 전달의 사용에 대한 조사는 크게 말초 청각 시스템에 이관되었다. 연구는 거의 중앙 청각 시스템에 유전자 전달을 조사 하였다. 청각 경로의 2 차 뉴런을 포함 뇌간의 등쪽 달팽이관 핵 (DCN)를, 유전자 전달을위한 잠재적 인 위치이다. 이 프로토콜에서 후두와 접근법을 통해 쥐의 DCN의 직접적이고 최대 노출에 대한 기술은 증명된다. 이 방법은 하나 급성 또는 생존 수술을 할 수 있습니다. DCN의 직접적인 시각화에 이어, 실험 호스트는 청색 레이저에 연결된 광 파이버에 의한 인공 핵 및 후속 자극으로 opsins의 주입을 포함 할 수있다. 이러한 전기 자극과 신경 인젝터 트레이싱과 같은 다른 신경 생리학 실험도 가능하다. visualiza의 수준기 및 자극 지속 기간은 달성 실험 광범위한 적용이 접근법 만든다.

서론

난청을 역전시키기 위한 바이러스 매개 유전자 전달은 주로 말초 청각 시스템에 집중되어 있습니다. ¹ 달팽이관을 표적으로 삼아 연구자들은 삼투압 미니 펌프 주입², 벡터-전이 유전자 복합체에 적신 젤폼®² 또는 젤라틴 스폰지³, 직접 마이크로 주입⁴을 포함한 다양한 전달 경로를 조사했습니다. 아데노 관련 바이러스 벡터^5,6, 렌티바이러스 벡터⁷ 및 양이온 리포좀을 포함한 수많은 유전자 전달^벡터; 및 표적 조직²를 넘어서는 유전자 전달 벡터의 보급. 가장 최근에는 수포성 글루타메이트 수송체-3의 소실로 인한 생쥐의 난청을 치료하기 위해 달팽이관에 아데노 관련 바이러스(AAV)-1이 도입되었습니다. ⁸ 또한, 말초 청각 시스템에서의 광유전학의 적용이 최근에 설명되었습니다. ⁹

개

그러나 중추 청각 시스템으로의 유전자 전달을 조사한 연구는 거의 없습니다. 뇌간의 등쪽 달팽이관 핵(DCN)에는 청각 경로의 2차 뉴런이 포함되어 있습니다. 달팽이관 핵(CN)의 유전자 전달 기술은 다양한 조사에 활용될 수 있지만, 빛에 민감한 단백질인 옵신(opsin)의 DCN으로의 유전자 전달은 광유전학 기반 실험 기술을 가능하게 하는 데 활용될 수도 있습니다. 채널로돕신-2(ChR2)와 같은 옵신의 바이러스 매개 유전자 전달 전달 후 DCN의 뉴런은 빛 자극에 민감해집니다. 광유전학적 유전자 전달은 이전에 쥐 레트로사다리꼴 핵(rat retrotrapezoid nucleus), 마우스 좌위 세포핵(mouse locus coeruleus), 원숭이 상구(monkey superior colliculus) 및 마우스 복부 피개(mouse ventral tegmental area)를 포함한 여러 뇌간 영역에서 시도되었습니다. ^{재질 보기 10-14}

일

최근 조사관들은 DCN에서 광유전학의 사용을 조사했습니다. ^15,16 DCN은 인간의 청각 뇌간 임플란트가 배치되는 위치로, 청각 신경 보철물에 대한 중개 연구를 위해 연구하기에 청각 시스템의 매력적인 부분입니다. 그러나 DCN의 위치를 감안할 때 수술 노출은 쉽지 않습니다. 본 명세서에 기술된 기술은 쥐 모델에서 바이러스 벡터 유전자 전달 및 광유전학 기반 실험을 가능하게 하기 위해 후방 포사(posterior fossa) 접근법을 통해 DCN을 최대한 노출시키기 위한 프로토콜을 제공한다. 이전 연구에서는 채널로돕신-2와 함께 DCN에 정위 미세주입을 사용했습니다. ¹⁶ 그러나 입위 주사는 특히 DCN과 같이 뇌간을 따라 작고 깊은 핵에서 직접 시각화에 의한 주사보다 잠재적으로 덜 정확합니다. CN에서 조직 특이적 단백질을 발현하는 형질전환 마우스도 매력적인 옵션이며 유전자 전달의 필요성을 없애줍니다. DCN 노출에 대한 당사의 프로토콜은 DCN이 광학 자극을 위해 직접 노출되어야 하기 때문에 형질전환 마우스에서도 작동합니다. DCN의 외과적 노출을 위한 이 기술은 마우스와 랫트 모델의 청각 신경 및 달팽이관 핵의 녹음을 포함하는 이전 프로토콜에서 채택되었습니다. ^15,17-20

호

프로토콜의 전반적인 목표는 유전자 전달 기술을 허용하기 위해 CN에 직접 노출을 제공하는 것입니다. 보다 구체적으로 말하면, 이 접근법은 급성 및 생존 수술 모두와 호환되며 후속 신경 생리학적 검사를 위해 동일한 동물에서 준비를 반복할 수 있습니다. DCN 프로토콜의 직접 노출은 뇌간의 다른 핵에서 광유전학 및 바이러스 매개 유전자 전달 기반 실험에 영향을 미칩니다.

프로토콜

참고 : 모든 실험 절차는 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 실험 동물의 사용을 포함하여 국가 동물 관리 지침을 따르 매사추세츠 눈의 동물 관리 및 사용위원회와 귀 의무실과 하버드 의과 대학,에 따라 수행된다 ILAR 가이드 및 동물 복지 법. 실험 절차는 왼쪽 DCN의 세부 노출 아래에 나열된. 생존 수술을 수행하는 동안 멸균 악기를 사용합니다.

1 차 개두술 등쪽 달팽이 핵 노출

1. 마취
   1. 복강 내 투여를 통해 자일 라진 (xylazine) 20 ㎎ / ㎏과 케타민 100 ㎎ / ㎏ 18-24 g의 무게 8~12주, 세 마우스를, 마취. 모니터링 심박수, 호흡 수,뿐만 아니라 발가락 핀치 철수 반사에 의한 적절한 마취를 확인합니다. 눈에 장소 수의사 연고 마취 동안 건조를 방지합니다. 일단 적절하게 마취, 면도 머리 위에 놓인 t그는 수술 부위에 접근이 수월를 제공하기 위해 두피.
2. 외과 위치
   1. 주둥이 클램프로 고정 작은 동물 정위 홀더에 안전하게 마우스를 놓습니다.
   2. 주둥이 클램프가 완전히 마우스의 머리를 고정하는 적절한 호흡하지만 꽉 충분히 허용 할 정도로 느슨한 있는지 확인하십시오. 마우스 머리가 느슨한 경우, 동물 절차의 개두술 부분에서 헤드 홀더에서 떨어질 가능성이있다.
   3. 심장 박동 모니터링 할 수 표준 방식에서 청성 뇌간 이​​식 전극을 배치합니다. 호흡 비율은 시각화하여 모니터링해야합니다. 정상적인 심장 박동과 호흡이 마우스의 연령에 따라 달라질 수 있습니다.
   4. homeothermic 가열 담요에 배치를 통해 온도계는 배치되고 euthermia이 보장된다.
3. 피부 절개하고 두개골의 interparietal과 뒤통수 뼈의 노출
   1. microsc에서OPE, 피부를 통해 수직 절개가 직접 날개 사이의 중간 선에서 시작하고, 후두부의 꼬리 부분까지 연장합니다. 정중선 피부 절개를 따라 횡 방향으로 피부를 변위. 두개골의 왼쪽 후방 측면을 덮고있는 근육을 시각화.
   2. 메스 홍채 가위와 각각의 뼈에 근육 첨부 파일의 이단에 의해 근육 왼쪽 정수리, interparietal 위에 놓인, 두개골의 후두 뼈를 제거합니다. 컷 근육의 가장자리를 따라 출혈의 작은 정도를 관찰한다. 10 ~ 15 초 동안 면봉으로 부드럽게 압력이 최소화.
4. 개두술을 덮는 인공 와우 핵
   1. 시상 및 람다 봉합 라인 (그림 1, 왼쪽 패널)을 포함하여 관련 봉합 라인을 확인합니다.
   2. rongeurs를 사용하여 람다 봉합 라인에 중간 선 왼쪽 interparietal 뼈를 통해 개두술, ~ 2mm의 꼬리를합니다. 이 지역은 DCN 위에 놓인다.
   3. 따라와g의 개두술은 소뇌 위에 놓여 두라의 얇은 층을 관찰합니다. 메스 블레이드를 사용하여 경질을 제거합니다. (그림 1, 가운데 패널).
      참고 : 경질의 제거는 약간의 출혈이 발생할 수 있습니다. 경질을 제거 메스 블레이드를 사용하는이 프로세스는 뇌간 표면 및 DCN 모호한 식별 할 풀, 소뇌 흡입 동안 혈액 손실의 양을 감소시키기위한 것이다. 마우스의 총 혈액량은 15 %보다> ~ 1.5 ml를 초과하지 않아야합니다. 출혈이 금액을 초과하면, 마우스는 유체 보충과 함께 제공되어야한다.
   4. 면 팁 어플리케이터 소뇌를 오버레이 응고 된 혈액을 제거합니다. 선택적으로, 부드럽게 혈액을 혈액을 멀리 취소 소뇌에 치과 지점을 사용하여 식염수 물방울.
5. 소뇌 포부
   1. DCN이 힘을 될 때까지 5 프랑스어 흡입을 사용하면, DCN 위에 놓인 왼쪽 소뇌의 측면 - 대부분의 부분을 대기음연간 (그림 1, 오른쪽 패널). 왼쪽 소뇌의 약 1/4 ~ 1/3를 제거합니다. DCN에 인접한 주요 랜드 마크는 우수한 반규관의 팽대부입니다.
      참고 : 소뇌의 포부는 프로토콜의 핵심 단계이다. 이 출혈의 원인이됩니다이 같은 흡입의 다중 패스와 함께 하나의 시도에서 발생하지 않을 경우 소뇌의 감독 흡입은 가장 성공적으로 수행된다. 흡입을 돕기 위해, 소뇌의 표면에 약간 원위 것이다 CN의 예상 깊이 현미경의 초점면을 설정한다. CN에 초점면을 설정하면 시각화를 개선하고 선명한 이미지를 보장합니다.
   2. DCN에 따라 흡입, 더 출혈, 뇌척수액 (CSF) 빌드 업, 그리고 소뇌 변위가 예상된다. 혈액 응고를 방지하기 위해 신속 개두술에 멸균 생리 식염수를 주입 시키 0.5 CC. 치과 점과 흡입과 부드러운 dabbing의 조합은 할 수있다DCN의 직접 시각화를위한 경로를 멀리 취소하는 데 사용됩니다. 직접 DCN의 표면에 접촉하지 마십시오.

바이러스 매개 유전자 전달 및 외과 복구를위한 2. 압력 미세 주입

1. DCN은 상부의 혈액과 뇌척수액의 무료이며 명확하게 볼 수 있습니다 후 2 분 동안 10 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 DCN에 압력 microinjections을합니다.
2. 팁은 더 이상 DCN의 표면 아래에 보일 때까지 미세 조작기로 바늘을 도입하지 않는다.
3. 최적의 성능을 위해, 외상을 최소화하고 얇은 DCN 내 주입 볼륨을, 지역화, 45 °로, 얕은 경사와 등을 33 또는 34 게이지 바늘 (34 게이지 바늘 기밀 주사기를 사용)을 사용하는 얕은 뇌간 구조 (<300 μm의 두께).
   참고 : 다른 미세 주입 장비가 활용 기초 할 수있다. 이상적으로, 주사 기기는 약간의 벤 있도록 유연해야D는 경우 직접 D​​CN을 대상으로 할 필요가 있었다. 마우스 인해 호흡에 절차 전반에 걸쳐 약간 이동하면서 또한, 악기는 운동의 소량을 견딜 수 있도록 충분히 견고해야한다.

3. 수술 복구

1. 주사 직후 피부를 다시 근사 및 마우스 표준 복구 절차 당 복구 할 수있다. 남은 소뇌와 흉터 조직은 소뇌의 흡인에 의한 공동으로 채울 것입니다. 충분한 의식이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 회복 될 때까지 지속적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 심박수, 호흡 수,뿐만 아니라 공급하는 능력을 모니터한다.
   참고 : 완전히 회복 될 때까지 아니 동물 수술을 한 다른 동물 케이지에 반환됩니다.
2. 마우스는 수술 후 원에서 도보로 시작하는 경우가 가능성이 힘든 시간 공급을하는 것처럼 (<사례 5 %), 피부 절개의 폐쇄 후 일반적으로 2-4 시간은, 바로, 마우스를 희생. 티그의 부작용으로 인해 소뇌 흡인하기 쉽다. 동물은 수술 후 통증에 대해 모니터링되어야하고, 적절한 마약 제도적 표준을 기반으로 동물의 편안함을 보장하기 위해 부여해야합니다. 항생제는 필요 감염의 경우 증거 할 수 있습니다.

4. 차 개두술 달팽이 핵 노출

1. 치유와 바이러스 매개 유전자 전달 배양 2-4 주 후, 이전에 주입 마우스 단계를 반복 1.1-1.5 최적의 배양 시간이 전송 유전자의 종류에 따라 다릅니다 다시 마취.
2. 핀셋, 메스 및 rongeurs의 조합에 의해 개두술 사이트를 통해 흉터 조직을 제거합니다.
3. 개두술을 시각화 한 후, DCN을 덮는 소뇌 및 흉터 조직을 나머지의 조합을 식별한다. 위에있는 소뇌 / (이전 소뇌의 열망과 유사) 흉터 조직을 흡인하기 위해 5 프랑스어 흡입을 사용합니다.
4. 흡인 후, 추가 출혈, 뇌척수액 B 기대uild 업 및 소뇌의 나머지 비트. 빠르게 혈액 응고를 방지하기 위해 식염수에 개두술을 소개한다. DCN의 직접 시각화에 대한 경로를 취소 부드러운 치과 점 dabbing 및 흡입의 조합을 사용합니다.
5. DCN의 표면을 관찰한다. DCN 이제 액세스 가능한 optogenetics 기반 생리학 실험을 수행합니다. optogenetics 기반 실험을 구동하기 위해, 광섬유 (도 2)와, 예를 들면 광 자극을 소개.

5. 조직학

1. 실험의 결론에 따라, 마취제의 과다 복용으로 마우스를 안락사. 4 % 파라 포름 알데히드이어서 생리 식염수로 마우스를 관류.
2. 2 시간의 두개골 및 사후 수정에서 뇌간의 압축을 풉니 다. 24 ~ 48 시간 동안 30 % 자당의 뇌간을 Cryoprotect. 제 60 ㎛의 섹션을 사용하여 표준 저온 유지 장치를 이용 뇌간.

결과

부분 소뇌 흡입은 코 클리어 핵에 대한 액세스를 보여줍니다

두개골을 덮는 피부와 근육이 같은 관상과 람다 봉합 선으로, 두개골 표면 랜드 마크를 제거한 후, 개두술의 대략적인 현지화를 보여줍니다. rongeurs와 개두술에 따라, 소뇌가 보여집니다. 소뇌의 작은 부분을주의 깊게 흡입 후 주입 할 수있는 CN, (그림 1)의 시각화를 보여줍니다.

블루 라이트 레이저로 자극에 대한 보조 인공 와우 핵 노출

DCN, 옵신과 유전자 전달 및 잠복기의 초기 노출 후, DCN이어서 청색 레이저 광에 의해 자극 될 수있다. 광 자극에 대한 DCN의 표면을 노출 차 개두술은 기본 개두술 (SUPP. 동영상 1) 기술적 접근 방식과 유사하다. DCN은, 인두께 미만 300 μm의 인 표면 구조. 실험 쥐의 준비는 6 시간까지에 ...

토론

이 논문은 중앙 청각 시스템의 조작 생쥐 모델에서 DCN의 직접 시각화 기술을 설명합니다. 직접 시각화의 설명 방식은 정위 적 방법을 주요 대안에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 정위 방법은 직접 시각화 여유가없는 반면, 주로, DCN의 직접 시각화, 뇌간의 사이트를 즉시 확인 할 수 있습니다. 바이러스 - 매개 유전자 전달의 경우에서와 같이, 인큐베이션 기간을 필요로 장기간 실험에서, 주입 대상 위치를 "그리워"저 IF 감염 효율에 대한 가능성이있다. 또한, 직접적인 시각화 방법은 다양한 동물 연령 주입을 허용한다. 유사한 접근 방식은 수술 래트 및 모르모트 등의 다른 동물 모델과 생존 실험에 사용될 수있다.

이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선,마우스가 정위 홀더에 제대로 위치해야합니다. 머리의 움직임은 어려움 개두술을 발생합니다. 둘째, 개두술의 위치는 매우 중요하다. 개두술이 적절한 위치에 만든되지 않으면 불가능하지 않을 경우, 소뇌의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
입체 택시 홀더	스톨팅	51500
동종 담요	하버드	507214
메스 블레이드 # 11	미세 수술 도구	10011-00
아이리스 가위	미세 수술 도구	14084-08
5 프랑스어 흡입	대칭 외과 2777914
치과 포인트	헨리 Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 &마이크로; l 해밀턴 주사기	해밀턴	7633-01
34 게이지, 바늘	해밀턴
Rongeurs	미세 수술 도구	16021-14