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방법 논문

물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

8.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52429

⸱

2015년 1월 11일

 , 
1Department of Biology and Marine Biology and Center for Marine Science, University of North Carolina Wilmington

이 논문에서

요약

이러한 생물학적 검정은 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스를 이용 농도 천연 해양 생물의 조직 유기 추출물로부터 병입 억지 대사의 존재를 평가하기위한 모델 육 물고기를 이용한다.

초록

해양 화학 생태학은 1980년대 천연 제품 화학자와 해양 생태학자의 협력으로 등장한 새로운 학문으로, 해양 생물의 조직에서 2차 대사 산물의 생태학적 기능을 조사하는 것을 목표로 합니다. 그 결과 실험적 접근 방식의 생태학적 관련성을 점점 더 구체화하는 프로토콜이 발전해 왔습니다. 여기에서 우리는 조사자가 해양 생물의 조직에서 2차 대사 산물의 항포식 활성을 평가할 수 있도록 하는 물고기 먹이 실험실 생물 검정의 최신 버전을 제시합니다. 모든 극성의 유기 대사 산물은 표적 유기체의 조직에서 철저하게 추출되어 영양학적으로 적합한 식품 매트릭스에서 자연 농도로 재구성됩니다. 실험용 식품 펠릿은 추출물의 항포식 활성을 평가하기 위해 실험실 사료 분석에서 일반 포식자에게 제공됩니다. 본원에 설명된 절차는 블루헤드, Thalassoma bifasciatum을 사용하여 카리브해 해양 무척추동물의 기호성을 테스트합니다. 그러나, 설계는 다른 시스템에 쉽게 적용될 수 있다. 이 실험실 분석을 사용하여 얻은 결과는 잠재적인 포식자의 완전한 보충물의 섭식 반응에 의존하는 현장 실험의 중요한 서곡입니다. 또한 이 생물학적 분석은 생물학적 분석 유도 분획을 통해 섭식 억제 대사 산물의 분리를 지시하는 데 사용할 수 있습니다. 이 섭식 생물 검정은 카리브해 산호초에서 해양 무척추 동물의 분포와 풍부함을 제어하는 요인에 대한 우리의 이해를 발전시켰으며 약리학, 생명 공학 및 진화 생태학을 포함한 다양한 연구 분야의 조사에 정보를 제공할 수 있습니다.

서론

화학 생태학 화학자 및 생태 학자의 협력을 통해 개발했다. 지상파 화학 생태학의 subdiscipline 몇 시간 동안 주변되었습니다 있지만, 해양 화학 생태학의는 몇 십 년 오래지만 해양 생물 1-8의 진화 생태학과 사회 구조에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 스쿠버 다이빙과 NMR 분광법의 응급 기술을 활용, 유기 화학자들은 빠르게 1970 년대와 1980 년대 9 저서 무척추 동물과 조류의 소설 대사를 설명하는 출판물의 큰 숫자를 생성합니다. 이차 대사 산물 경험적 증거도없이 새로운 화합물에 생태 학적으로 중요한 특성을 관찰 작용이 책의 많은 어떤 목적을 봉사해야한다는 것을 가정. 약 동시에, 생태도 분포 이전에 이리저리 알려진 저서 동물과 식물의 풍부함을 스쿠버 다이빙의 출현을 활용하고 설명했다준설 상대적으로 비효율적 인 샘플링 방법을 해요. 이러한 연구자의 ​​가정은 고착 아무것도 부드러운 바디 화학적 육식 동물 (10)에 의해 소비를 방지하기 위해 방어해야이었다. 종 중 농도에 달리 설명 작업 사용했던 경험주의를 소개하는 노력의 일환으로, 일부 생태 독성 분석 (11)에서 화학 방어를 외삽하기 시작했다. 대부분의 독성 분석은 절반 분석 유기체를 죽이는에 대한 책임 추출물의 건조 질량 농도의 후속 결정으로, 전체 물고기 나 무척추 동물 조직의 원유 유기 추출물의 수성 현탁액에 다른 생물의 노출을하고있었습니다. 그러나 독성 분석은 잠재적 인 포식자가 자연 상태에서 먹이를 인식하는 방식을 모방하지 않으며, 후속 연구는 독성과 기호성 12 ~ 13 사이의 관계를 발견했다. 그것은 권위있는 저널에 출판이 거의 또는 전혀 ecologica을 가진 기술을 사용하는 것은 놀라운 일이다L 관련성 14-15 것을이 연구가 아직 널리 인용된다 오늘. 그것은 독성 데이터를 기반으로 연구 16-18을 게시 할 계속주의하는 것이 더욱 놀랍다. 여기에 설명 된 생물 검정 방법은 antipredatory 화학 방어를 평가하기 위해 해양 화학 생태에 대한 생태 학적으로 중요한 접근 방법을 제공하기 위해 1980 년대 후반에 개발되었다. 방법은 생태 학적으로 의미있는 독성 데이터보다 기호성 데이터를 제공, 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스 천연 농도 대상 유기체로부터 조 유기 추출물을 샘플링 포식자 모델을 필요로한다.

(1) 적절한 제너럴 육식 동물이 먹이 분석에 사용되어야한다, (2) 모든 극성 유기 대사가 철저의 조직에서 추출해야합니다 해양 생물의 조직의 antipredatory 활동을 평가하는 일반적인 방법은 네 가지 중요한 기준을 포함 생물체를 대상으로, (3) 대사 ㄴ해야같은 체적 농도 영양 적절한 실험 음식에 혼합 전자는 그들이 추출하고, (4) 실험 설계 및 통계 방법은 의미있는 메트릭이 상대 distastefulness을 표시하기 위해 제공해야하는 유기체에서 발견.

아래에 설명 된 절차는 카리브해 해양 무척추 동물에 antipredatory 화학 방어를 평가하기 위해 설계되었습니다. 이 종은 카리브해 산호초에 공통이며, 저서 무척추 동물 (19)의 넓은 구색을 샘플링 알려져 있기 때문에 우리는 모델 육식 물고기 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum을 사용합니다. 표적 조직은 유기체로부터 먼저 추출 식품 혼합물과 결합하고, 마지막 T. 그룹에 제공되며 bifasciatum은 추출물 처리 된 음식을 거부 여부를 관찰합니다. 이 방법을 사용하여 분석 데이터는 해양 생물 12,20-21, L의 수비 화학에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다IFE의 역사 절충 22-24, 지역 사회 생태 25-26.

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프로토콜

참고 :이 프로토콜의 3 단계는 척추 동물의 과목을 포함한다. 절차는 동물이 가능한 가장 인도적인 치료를받을 수 있도록 설계되었으며, 노스 캐롤라이나 윌 밍턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1) 조직 추출

  1. 이 이차 대사 산물의 체적 농도를 변경하므로 수화가 아닌 압착, 건조 아웃 또는 지나치게 젖은의 자연 상태에있는 조직을 사용합니다. 리거나 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 삽입 할 수있는 부분 또는 슬라이스로 조직 들어온다. 참고 : 신선한 조직은 경우에 따라 사용될 수 있지만,자를 때 압착 적용​​되지 않는 고정 된 조직을 잘게 자르거나하는 것이 낫다.
  2. (1) 30 ㎖에 조직편을 추가 40 ㎖의 최종 부피까지 졸업 원심 분리 튜브에서 한 혼합물을 디클로로 메탄 (DCM)과 메탄올 (MeOH 중하는)에 도달한다. 의 전송을 포함하는 모든 단계를 수행해야합니다적절한 환기와 흄 후드에서 용매.
  3. 튜브를 씌우고 그것을 여러 번 반전 한 후 4 시간 추출 기간 동안 반복적으로 선동. 주 :이 기간 동안 물을 MeOH와 결합하고, 생성 된 메탄올 : 물상은 DCM 상으로부터 분리한다. 조직 교대 DCM 및 메탄올에 노출되어 물을 에멀젼으로서 튜브 교반 된 바와 같다.
  4. 둥근 바닥 플라스크에 DCM 추출물을 전송 및 낮은 열을 이용 회전 증발기에서 증발 건고 (<40 ° C). 최소한의 용매를 사용하여, 20 ㎖의 섬광 바이알에 건조 된 추출물을 전송. 회전 증발기 어댑터 바이알 맞고 다시 낮은 열을 이용 회전 증발기에서 증발 건고 (<40 ° C).
    주 : (1) 너트 (2) 와셔, 및 (3) 도토리 너트 : 다음 단계는 나사산로드의 단부 상에 순차적으로 다음 항목을 나사 결합에 의해 조립 될 수있는 제 압축 장비의 사용을 요구한다. 세탁기 중 하나를 천공해야 또는그것은 50 ㎖ 원심 분리 튜브의 내부 지름보다 작도록 끼워.
  5. 조직 및 메탄올이 포함 졸업 원심 관으로 되돌아 : 물 추출물을 통해 압축 조직에서 추출 매질을 짠다. 메탄올로 이동 : 같은 둥근 바닥 플라스크에 물 추출물을 냉장 보관 (<10 ° C).
  6. 물 추출물 : 다음 새 메탄올은 메탄올이 들어있는 냉장 둥근 바닥 플라스크에 압축 전송, 지금은 탈수 조직이 2 ~ 6 시​​간 지속 시간의 두 번째 추출에 빠져들 때까지 졸업 원심 분리기 튜브에 메탄올을 추가합니다. 조직이 충분히 추출되지 않았다고 임의 우려가있는 경우, 2 시간 내지 6의 MeOH 추출을 반복한다.
  7. 낮은 열을 사용하여 회전식 증발기에서 메탄올을 건조시키고 (<40 ° C). 둥근 바닥 플라스크를 헹구어의 MeOH를 사용하여 최소한의 볼륨, 건조 비극성 추출물을 함유하는 섬광 바이알로 둥근 바닥 플라스크에서 남은 수용성 추출물을 전송.
  8. E진공 농축기에 낮은 열 (<40 ° C)를 사용하여 건조시켜 수용성 추출물을 vaporate. 섬광 유리 병은 이제 조직 10 ㎖의 총 건조 원유 유기 추출물이 포함되어 있습니다. , 산화를 방지하기 위해 N 2 가스로 유리 병의 헤드 공간을 대피 단단히 밀봉 및 저장 냉동 (-20 ° C).

2) 음식 준비

  1. 동결 건조 오징어 맨틀 분말을 준비합니다.
    주 : 오징어 맨틀 다른 저생 무척추 동물에 필적하고, 2.2의 하위 단계에 성분으로 사용될 영양의 공급원을 제공한다.
    1. 따뜻한 탈 (DI) 물 오징어 맨틀의 해동 냉동 반지, 다음 고속 믹서기에서 그들을 퓌 레.
    2. 얕은 쿠키 시트 및 동결 (-20 ° C)에 퓌레 오징어 맨틀의 얇은 층을 붓고, 그 다음 작은 조각으로 동결 건조 할을 냉동 오징어 퓌레의 시트를 휴식.
    3. FR의 운영 절차에 따라 냉동 오징어 맨틀 퓌레를 동결 건조eeze 건조기.
    4. 분말을 형성 고속 블렌더 오징어 맨틀 퓌레의 동결 건조 된 조각을 분쇄.
    5. 흄 후드에서 회전 밀가루를 체로 치는으로 분말 오징어 맨틀을 부어 미세 분말로 조직의 큰 덩어리를 분리하는 선별.
    6. 밀봉 용기에 미세 분말 오징어 맨틀을 전송합니다. 산화를 방지하고 냉동 저장하는 N 2 가스로 용기 헤드 공간을 대피 (-20 ° C).
  2. 식품 혼합물을 준비합니다.
    참고 : 필요한 경우 연속 된 여러 분석을 실행할 때, 그것은 ~ 음식을 혼합 100 ㎖를 준비하는 것이 실용적이다, 그러나이 조리법은 작은 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
    1. 150 ㎖ 비이커에 3g 알긴산 DI 물 100㎖로 5g을 동결 건조 오징어 맨틀 분말 혼합물을 결합. 분말이 완전히 수화하고, 혼합물이 균질해질 때까지 몇 분 동안 격렬히 교반하여 microspatula.
      원하는 경우, 식용 색소는 본 보안 목표 명세서에 추가 할 수 있습니다 참고EP : 오히려 첨가하여 추출 처리 혼합물의 색상을 일치하려고하기보다는 (추출물 처리 혼합물 추출물의 천연 색소 마​​스킹) 모두 처리 및 제어의 혼합물을 생성 식품 혼합물에 염료를 추가하는 것이 더 쉽다 제어 염료 혼합물. 녹색을 띤 갈색 또는 식품 색상 조 추출물에서 어떠한 안료를 마스크하는 것이 바람직하다.
    2. 졸업 주사기로 음식을 혼합 10 mL를 정확하게 넣습니다. 이 과정에서 기포의 혼입을 방지하기 위해주의한다.
    3. 냉동 건조 원유 유기 추출물 20 ㎖ 섬광 유리 병을 제거합니다. 드롭을 추가 또는 메탄올의 두 사람은 다음 microspatula와 균일 한 혼합물에 추출물을 저어.
    4. 20 ㎖ 섬광 유리 병에 음식 행렬의로드 10 ML의 주사기를 꺼내 추출물 처리 된 음식 혼합물을 균질화 microspatula 저어.
      R 다음, 그것은 작은 단위 (예에서 주사기를 배출하는 데 도움이 될 수 2 ml의 배출 및 균질화 :. 참고모든 10 ml의 때까지 EPEAT)의 균질화되고있다.
  3. 분석 알약을 준비합니다.
    1. 주사기로 추출 혼합물 (~ 1 ㎖)의 매우 작은 체적을로드하고, 0.25 M의 CaCl2를 용액에 주사기 팁 잠수함. 긴 형상 스파게티 스트랜드를 형성하도록 주사기의 내용물을 꺼내기.
    2. 몇 분 후, 다음, 면도날 유리 커팅 보드에 4mm 긴 펠릿으로 들어온다, 경화 가닥을 제거 해수를 세정한다.
    3. 반복 제어 알약을 만들기 위해 조직 추출물을 포함하지 않고 2.3.1와 2.3.2 단계를 반복합니다. 용매의 동등한 볼륨 제어 알약을 치료해야 용매 추가 할 제어 (단계 2.2.3에서 처리 혼합물에 메탄올을 첨가 참조). 음성 대조군, 즉 분석 물고기가 먹이 단념 할 수 확인이 MG ml의 농도에서 denatonium 벤조 에이트를 추가 -1 원시 음식 혼합물 (27)로하는 것이 바람직합니다.

3) 기호성생물 검정

  1. 자연산 노란색 상 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum와 공급 분석을 수행, 실험실 수조의 불투명 양면 구획의 세 그룹으로 유지했다.
  2. 고무 전구 유리 피펫을 사용하여 해수의 비이커에서 식품 알약을 제공합니다. 참고 :이 방법으로 음식을받을 물고기를 양성하는 몇 일이 걸릴 수 있습니다. 음식의 전달을 앞에 조절 자극 (수족관 유리 피펫의 예를 몇 가지 탭은) 음식 펠릿의 추가를 기대하는 물고기를 훈련하는 것이 도움이 될 수있다.
  3. 알약을 채점. 쉽게 물고기에 의해 소비되는 경우 펠릿 허용 고려하십시오. 자신의 구강에 걸릴 하나 이상의 물고기에 의해 세 번 최소 후에 먹게하지 않을 경우 펠릿이 거부 고려, 펠릿 접근하고 하나의 시도 후 무시 된 경우에는.
  4. 점수 샘플. 참고 : 분석 절차는 그림 1에서 플로우 차트로 묘사된다 식사를 거부 물고기의 그룹.프로토콜의 모든 단계에서 제어 펠렛을 추가로 간주되지 않습니다. 분석의 단일 실행의 두 가지 잠재적 인 결과가 있습니다 샘플 허용 또는 거부 중 하나.
    1. 물고기의 그룹이 협력 여부를 확인하기 위해서 제어 펠렛과 함께 시작합니다. 처리 된 펠렛을 제공합니다. 물고기가 처리 된 펠렛을 수락하면 수락으로, 샘플 점수. 물고기가 처리 된 펠렛을 거부 할 경우, 물고기가 먹이를 중단 여부를 결정하기 위해 후속 제어 펠렛을 제공합니다. 물고기가 후속 제어 펠렛을 적용하는 경우 거부로, 샘플 점수.
  5. 복제. 각 추출물에 대한 물고기의 열 독립적 인 그룹과 분석 절차를 반복합니다.

4) 평가 의의

  1. 피셔의 정확한 시험 (26)의 수정 된 버전으로 처리 펠릿 VS 제어 소비의 차이의 중요성을 평가한다. 컨트롤에 대한 한계 합계 및 치료 펠릿 고정되도록 테스트를 수정그들에게 모두 무작위 샘플을 치료. 참고 :이 페이지 제공 = 0.057 7 펠렛을 먹을 때; 7 이상의 펠릿을 먹을 경우 따라서, 어떤 추출물을 6 개 이하의 펠릿을 먹을 경우 억지력으로 간주하고 맛이있다.
  2. 추출물의 집단 간의 상대적 기호성을 비교하기 위해, 각 그룹 내에서 먹을 펠릿의 평균 수를 계산합니다. 펠릿의 평균 수는 + 먹을 경우 너무 복제 추출물의 그룹이 억지력으로 간주됩니다 6 펠릿 임계 값을 유지 표준 오차 (SE) ≤6. 주 : 대표적인 결과, 그룹 할당은 종이므로 복제 추출물을 구별 개체로부터 와서 상대 기호성 종간 비교 될 수있다.

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결과

여기에 우리가 일반적으로 카리브해 스폰지의 여섯 종 (그림 2)이 생물 검정의 결과를보고합니다. 이러한 데이터는 처음 Pawlik 등. (12)에 의해 1995 년에 출판 및 공동 발생하는 분류군 중 화학 방어 전략의 차이를 조사하기 위해이 방식의 힘을 보여되었다. 결과는 표준 오차 (SE) 각 종 + 먹은 음식 펠릿의 평균 숫자로보고되었다. 거의 펠릿 Agelas의 clathrodes, Amphimedon compressa 및 Aplysina의 cauliformis에서 원유 유기 추출물과 분석에서 먹게되지 않았다. 반면, Callyspongia vaginalis에, Geodia의 gibberosa 및 Mycale laevis의 추출물로 만든 펠릿을 쉽게 분석 (12)에서 소비되었다. 6 개 이하 펠릿은 처음 세 종 먹게되었다, 그래서 그들은 크게 고려 제지했다. 대조적으로, 제...

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토론

본원에 기술 된 절차에 antipredatory 해양 생물 화학적 방어를 평가하기위한 상대적으로 간단하고, 생태 학적으로 중요한 실험 프로토콜을 제공한다. 여기에서 우리는 방법이 세트에 만족하는 중요한 기준을 검토 :

(1) 적절한 육식 동물.이 공급 분석은 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum, 카리브해 전역의 산호초에 가장 풍부한 물고기 중 하나를 사용합니다. bluehead 저서 성 무척추 동물 (19)의 넓은 구색을 샘플링 알려진 제너럴 육식 동물이다. 포식자가 암초에 약탈하는 물고기의 대부분은 제너럴 때문에 이러한 초기 분석을위한 최선의 선택이며, 그것은 방어를 우회하는 메커니즘을 진화 할 수 있습니다 전문 포식자에 반대 antipredatory 방어가 광범위하게, 그들에 대항 할 것으로 예상된다. 하나의 잠재적 인 포식자를 사용하여 화학 방어 연구소의 설문 조사의 아르...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 비디오의 촬영 및 편집에 도움을 주신 James Maeda와 Aaron Cooke에게 감사드립니다. 기금은 국립과학재단(National Science Foundation, OCE-0550468, 1029515)에서 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디클로로메탄피셔 사이언티픽D37-20
메탄올피셔 사이언티픽A41220
무수 염화칼슘피셔 사이언티픽 피셔 사이언티픽C614-500
크라이오쿨 열전달 유체피셔 사이언티픽20-548-146진공 농축기용
알긴산 나트륨 염 고점도MP Biomedicals
오징어 맨틀 링N/AN/A식료품점에서 구입할 수 있습니다
Denatonium benzoateAldrichD5765
50ml 눈금 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-432-22
20ml 섬광 바이알Fisher Scientific03-337-7
일회용 파스퇴르 피펫Fisher Scientific13-678-20D
파스퇴르 피펫용 고무 전구Fisher Scientific03-448-24
펠릿 전달용 빨간색 전구Fisher Scientific03-448-27
250ml 둥근 바닥 플라스크Fisher Scientific10-067E
로타밥용 섬광 바이알 어댑터Fisher ScientificK747130-1324
웨이트보트Fisher Scientific02-202B
마이크로주걱Fisher Scientific21-401-10
5ml 눈금 주사기Fisher Scientific14-817-53
10ml 눈금 주사기Fisher Scientific14-817-54
면도날Fisher ScientificS17302
154723

참고문헌

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