녹색 형광 단백질 유전자가 발견된 이래로 형광 단백질은 분자 세포 생물학에 영향을 미쳤습니다. 이 프로토콜은 유전 공학을 통한 뚜렷한 형광 단백질의 발현이 개별 세포를 바코드로 만드는 데 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이 절차를 통해 세포 혼합물에서 고유한 집단을 추적할 수 있으며, 이는 다중화 응용 분야에 이상적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 단백질, 형광 염료 및 형광단은 일반적으로 분자 세포 생물학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 특히, 형광 단백질과 그 유전자의 발견으로 국소화를 위한 단백질 융합 엔지니어링, 관심 단백질의 전사 활성화 및 번역 분석 또는 개별 세포 및 세포 집단의 일반적인 추적이 가능해졌습니다. 레트로바이러스 기술과 함께 형광 단백질 유전자를 사용하면 포유류 세포에서 이러한 단백질을 안정적이고 신뢰할 수 있는 방식으로 발현할 수 있게 되었습니다. 다음은 이러한 유전자를 활용하여 세포 집단 내의 세포에 고유한 생체 신호를 부여하는 방법을 보여줍니다. 레트로바이러스 기술로 생체 서명이 이루어지기 때문에 세포는 '무기한' 바코드가 부착됩니다. 따라서 바코드가 부착된 세포의 혼합물 내에서 개별적으로 추적할 수 있으며 보다 복잡한 생물학적 응용 분야에 활용할 수 있습니다. 세포 혼합물에서 뚜렷한 집단을 추적하는 것은 다수의 표적에 대한 약물 발견 또는 서로 다른 프로모터의 활성화 프로필과 같은 다중화 응용 분야에 이상적입니다. 이 프로토콜은 뚜렷한 유전적 형광 마커를 가진 바코드가 있는 포유류 세포를 우아하게 개발하고 증폭하는 방법과 한 번에 여러 마커를 사용하거나 다른 강도에서 하나의 마커를 사용하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 다중화를 통한 분석 능력을 높이기 위해 세포 기반 분석과 함께 세포를 추가로 활용할 수 있는 방법을 설명합니다.
서론
이러한 형광 분광법, 형광 현미경 및 유동 세포 계측법 같은 기술은, 모두 형광에 의존 속성은 널리, 생화학 생물 의학, 화학 응용 프로그램에서 악용. 형광 극한 또는 라벨링을 통해 단백질 발현 패턴과 프로필, 세포의 운명, 단백질 결합 및 생물학적 기능 1-9의 분석을 위해 이용하고,되었는지 생체 분자 상호 작용 및 구조 변화의 검출을위한 형광 / 포스터 공명 에너지 전이를 통한 10-13. 빅토리아 (Aequorea victoria) 녹색 형광 단백질 (GFP) (14)의 분리 이후, 다른 자포 동물, 특히 산호로부터 추가 천연 형광 단백질의 발견은, 크게 구별 여기 / 발광 스펙트럼을 가진 기존의 형광 단백질의 수가 증가하고있다. 이 함께 유전자 15-19의 돌연변이의 도입으로, 근래전자는 또한 자신의 연구를위한 세포 계측법 및 기타 형광 기반 기술 흐름, 현미경을 이용 과학자 사용할 수 형광 단백질의 진정한 표를 획득, 가능성을 확장했다.
이와 병행하여, 독립적이지만, 레트로 바이러스 기술의 개발이 크게 포유 동물 세포에서 20-23 이소성 유전 정보의 발현 안정성을 촉진했다. 그것은이 기술은 세포 및 조직 유형의
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프로토콜
포유 동물 세포, 유전자 바코드에 대한 바이러스 생산 및 형질 도입 1. 준비
- 10cm 접시에 플레이트 2.5 × 10 6 부착 세포 (또는 주위 50-60%의 컨 플루) 둘 베코의 수정 독수리 중간 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FCS)에 Transfection 하루 전날. 이러한 피닉스 GP (게리 놀란, 스탠포드 대학에서 일종의 선물)와 같은 선택의 레트로 바이러스 생산 사용 포장 세포 라인.
주 : 패키징 세포주는 안정적 트랜스 레트로 바이러스 입자 형성 용 개그 단백질 및 폴을 나타낸다. 확인 세포가 이전에 형질에, 건강하고 단층의 판에 부착 해드립니다. - 24 시간 후, DNA 형질 전환 혼합물을 제조한다.
- 무 혈청 DMEM 125 ㎕를 3 μg의 구내염 바이러스 봉투 당 단백질 벡터 (PCI-VSVG)과이자의 형광 단백질 유전자를 운반하는 전이 벡터의 3 μg의를 추가합니다. 2 ㎎ / ㎖ (혼합 및 폴리 에틸 이민의 15 μl를 추가).
- 실온에서 15 분간 인큐베이션하고, 혼합물을 적가 셀에 추가한다.
주 : 폴리 에틸 이민은 폴리 플렉스의 형성을위한 형질 전환 시약으로서 균질 DNA 혼합물에 첨가 하였다. 다른 형광 단백질 마커를 운반하는....
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결과
다중화 형광 유전자 개별 클론 집단이 생성되면 만 달성 될 수 생물학적 응용을 목적으로 세포를 바코드. 바코드 인구가 최소한의 스펙트럼 오버랩 명확 별개의 형광 특성이있을 때 다중 가장 효과적입니다. 포유류 SupT1 세포의 클론 집단으로도 1에 도시 된 예와 mCherry 아노 형광 단백질 (CFP)와 바코드 세포 용이 개별 형광 특성을 잃지 않고 동시에 분석 할 수 있음을 나타낸다. 이 행렬은 따라서 아직 사용 가능한 추가 채널의 판독과 다중 생물학적 응용 프로그램에 사용할 수 형광 유전자 바코드 세포의 패널을 예시한다. 이러한 패널을 얻기 위해서는 그 때문에 삽입 성 EF로 모집단 내의 형광 강도의 가변 범위로 이어질 것이다 레트로 바이러스 기술의 특성을 기억하는 것이 중요fects 및 / 또는 MOI. 2 예시도 그 바이러스 입자가 세기의 다양한 (왼쪽 패널)에서 형광 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두를 발현하는 세포에서 어느 TD 토마토 또는 E2 크림슨 .......
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토론
여기에 두 잘 확립 된 절차가 결합되었습니다; 레트로 바이러스 및 기술을 이용하여 유세포 형광 단백질의 검출을 통해 유전 공학. 고유 세포주의 제조 계 형광 단백질 유전자 바코드 다중화 애플리케이션 견고하고 간단한 방법을 제공한다. 레트로 바이러스 유전자 조작 기술을 통해 세포 바코드를 생성하는 초기 긴 과정이지만, 한 번, 셀 물질의 신뢰성 있고 안정된 소스를 설립 얻게한다. 이 기술의 본질은 지속적으로 자신의 진정한 구별 biosignature가 정상 형광 특성을 가진 유전자 조작 세포 라인을 생산하고 있습니다.
두 점착성 및 비 점착성 세포 유형은 그들의 물리적 흡수 / 방출 스펙트럼에 기초하여 쉽게 구별 형광 단백질을 이용하여 바코드 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 이러한 CFP, mCherry 같은 단백질에 한정되는 것은 아니다, E2 크림슨 및 TD 토마토. 유전자들이 구별 형광 단백질 바코드되면, 그들은 세포 집단의 패널을 생성하기 위해 결합 될 수있다. 중요.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는 레트로 바이러스 입자의 생산을 위해 피닉스 GP 포장 세포주를 제공하기 위해 스탠포드 대학에서 박사 게리 놀란에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 TD 토마토를 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학에서 박사 로저 첸 감사합니다. 우리는 또한 자신의 서비스와 도움을 샌디에고 주립 대학 유동 세포 계측법 핵심 시설에게 감사의 말씀을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10ml 주사기 | BD | 309604 | 를 필터링하는 데 사용됩니다 |
| . m ploytetrafluoroethylene filter | DMEM | Pall Corporation | 4219 |
| HEK 293T 세포용 | Corning | 45000-304 | |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml 농도 사용 |
| 행잉 버킷 원심분리기 (냉장) | Eppendorf | 5805 000.017 | 사용 스핀 감염 |
| PBS (인산염 완충 식염수) | Corning | 21-040-CV | 세포 세척에 사용 |
| 폴리 브레네 (hexadimethreen bromide) | 시그마-알드리치 | 107689 | 바이러스 감염 효율을 높이기 위해 사용됩니다. 5 µ에 사용하는; g/ml 농도. |
| 세포 집단 분류에 사용되는 | FACSAria | BD Biosciences | |
| 세포 분석에 사용되는 | FACSCanto | BD Biosciences | |
| 레트로바이러스 입자 생성에 사용되는 Gary | Nolan | Phoenix-GP | |
| 태아 송아지 혈청 | Mediatech | MT35015CV | 세포 성장 및 분류에 사용됨 |
| ATCC | CRL-1942 | 인간 T 림프모세포 | |
| HEK 293T 세포 | ATCC | CRL-11268 | SV40 대형 T-항원 |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | SupT1 세포용 |
참고문헌
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527....
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재인쇄 및 허가
