나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

Nina Milosavljevic; Mallorie Poët; Michael Monet; Eléonore Birgy-Barelli; Isabelle Léna; Laurent Counillon

doi:10.3791/52453

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

나의 기능적 특성

8.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52453

⸱

2015년 3월 30일

Nina Milosavljevic^*¹ , Mallorie Poët^*¹ , Michael Monet¹ , Eléonore Birgy-Barelli¹ , Isabelle Léna¹ , Laurent Counillon¹

¹Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 글의 첫 번째 부분에서는 원형질막에서 소포성 Na⁺/H⁺ 교환체를 발현하는 돌연변이 세포주를 선택하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 부분에서는 세포 내 pH 측정 및 빠른 이온 흡수를 기반으로 하는 프로토콜을 제공하며, 이는 이러한 교환기의 이온 선택성과 운동 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다.

초록

엔도 솜 산성화는 시냅스 소포의 단백질 분해 및 재활용, 둔감 수용체 및 신경 전달 물질의 로딩 등의 처리, 다양한 중요하다. 이 산성화는 CLC 염화 컨베이어에 결합 된 양성자 -ATPase를,에 의해 매개되는 기술되어있다. electroneutral 양성자 수송을 고도로 보존, 나 ⁺ / H ⁺ 교환기 (NHE) 6, 7, 9는 이러한 구획에서 표현된다. 유전자의 돌연변이는 인간의인지 적, 신경 퇴행성 질환과 연결되어있다. 자신의 세포 내 현지화 상세한 기능 특성을 방지 것처럼 역설적으로 자신의 역할은 애매 남아있다. 이 논문은이 문제를 해결하는 방법을 나타내고있다. 이것은 세포막에서 세포를 유지하여 NHEs 급성 세포질 산성화 생존 가능한 돌연변이 세포주의 선택으로 구성. 그러므로 이온 선택성 및 활성을 측정하기 위해 두 개의 상보적인 프로토콜을 도시(ⅰ) 하나의 비디오 형광 현미경을 사용하여 세포 내 pH 측정에 기초하고, (ⅱ) 하나의 리튬의 빠른 흡수 동력학에 기초한 이러한 교환기. 이러한 프로토콜은 다른 비 electrogenic 수송차를 측정하도록 외삽 될 수있다. 또한, 여기에 제시된 선택 절차는 세포 표현형으로 고정 불량 셀을 생성한다. 따라서, 이러한 세포는 세포막에서 다른 소포 막 단백질을 발현한다. 여기에 묘사 된 실험 전략은 따라서 다음 소낭 ⁺ / H ⁺ 선택에 사용 교환기 나트륨과 함께 세포막에서 발현된다 다른 세포 내 단백질을 연구하기 위해 잠재적으로 강력한 도구를 구성 할 수있다.

서론

대부분의 세포 내 구획 성숙, 인신 매매, 단백질이나 호르몬과로드 신경 전달 물질의 재활용을위한 핵심 매개 변수입니다 산성 내강의 pH를 표시합니다. 그것은 세포질 포성 내용 사이의 pH 구배 소포 CLC 클로라이드 컨베이어 ^(2)에 결합 된 액포 H ⁺ -ATPase를 ^(1)에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 두 녹아웃 (KO) 마우스 및 인간 환자에서, 이들 컨베이어의 중요성 ^3-6 유전자 돌연변이로 인한 무거운 표현형에 의해 강조되었다.

나트륨 수소 교환기 SLC9A 가족의 구성원, 또한 나트륨 ⁺ / H ⁺ 교환기 NHEs 불리는 세포 내 pH 및 세포 볼륨 조절 키 이펙터에서뿐만 아니라 상피 걸쳐 산 - 염기 당량의 vectorial 수송 것으로 나타났다 . 세포막 NHEs 외에도 세 고도로 ⁺ / H ⁺ 기, NHE 6, 7은 Na 보존9는 트랜스 - 골지 네트워크에서 초기 엔도 좀 ^(7)로 표현된다. 유전자의 돌연변이는 엔젤 형 또는 크리스찬 증후군 ^8-9, 가족 기반의 자폐증 ^(10)와 주의력 결핍 과잉 행동 장....