이 절차의 목표는 미세조류 스크리닝을 위해 마이크로타이터 플레이트 형식을 사용하는 재현성과 적응성을 입증하는 것입니다. 이 신속한 스크린은 WATER-PAM(Pulse-Amplitude-Modulated) 형광 측정법을 결합하여 소량의 박테리아-조류 공동 배양과 함께 Photosystem II(PSII) 건강 지표로 광합성 수율을 측정합니다.
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방법 논문
작은 볼륨 생물 검정은 물 - 펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정을 사용하여 세균 / 식물 플랑크톤의 공동 문화를 평가하는
이 논문에서
요약
초록
배양 실험 1-7에 걸쳐 서브 샘플링 될 수 있도록 미세 조류의 실험 조작을위한 종래의 방법은 대량 배양 (5 L 내지 20 ml)에 사용했다. 대량의 서브 샘플링 다양한 이유로 문제가 될 수있다 : 1)는 총 부피와 표면적의 변화 원인은 다음 실험 기간 동안 배양 체적비; 2) 의사 복제 (즉, 동일한 치료 플라스크 8에서 샘플)는 종종 오히려 진정한 복제물 (복제 치료에서 즉, 샘플링)보다 채용을 복제; 3) 실험 기간은 총 부피에 의해 제한된다; 4) 배양 무균 또는 일반적인 세균 미생물 오염은 일반적으로 서브 샘플링 동안 발생 장기 실험 동안 유지하기 어렵다.
미세 적정 플레이트의 사용은 최대 48 내의 별도의 처리 1 ㎖의 각각의 배양에 사용되는 복제 볼륨을 가능12.65 X 8.5 X 2.2 cm 판함으로써 실험 볼륨을 감소하고 치료를 서브 샘플링하지 않고 광범위한 복제를 허용. 9-11 스크리닝 세균성 조류 공동 배양, 조류 생리 테스트 및 독소 : 또한,이 기술은 실험을 포함한 다양한 포맷에 맞게 수정 될 수있다. 조류, 박테리아 및 / 또는 공동 문화와 개인 우물로 제한 등 다양한 실험 절차에 대한 샘플링,하지만 할 수 있습니다 WATER-펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정, 현미경, 세균 집락 형성 단위 (CFU) 수와는 유동 세포 계측법. 마이크로 타이 터 플레이트 포맷 WATER-PAM 형광 측정의 조합은 광 화학적 수율 및 샘플, 높은 재현성과 낮은 가변성과 다른 광 화학적 파라미터의 다수의 신속한 측정이 가능하며 실험의 과정 속에 든 대형 유리 병 또는 원추형 플라스크를 서브 샘플링 많은 함정을 피할 .
서론
식물 플랑크톤의 생리는 전통적으로 원뿔 플라스크에 20 ㎖에서 carboys 1-7에서 5 L에 이르는 메조 규모의 실험에서 연구되어왔다. 각 시점에 대한 복제 샘플을 희생하는 것이 관리하기 어려운 실험 장치를 만들어으로이 실험 규모는 실험 모니터링을위한 서브 샘플링을 필요로한다.
줄이거 나 대량의 서브 샘플링 및 의사 - 복제의 제한을 제거한다 조류 생리학 실험 실험 용적을 소형화하여 일주 동일한 인큐베이터 공간을 사용하면서 기능은 독립적 인 실험의 수를 증가시키는. 마이크로 타이 터 플레이트 포맷은 가변 실험적 조건에서 조류를 조작 1ml의 배양 부피를 사용하여 조류 생물 검정을 위해 개발되었다. 실험이 작은 부피 복제물의 수가 증가 될 수 있도록 허용 복제에 의한 샘플 간의 감소 가변성 실험의 재현성을 증가(그림 2) 12 1백40일에 대한 실험 컨트롤 (즉, 무균 조류 배양)를 유지하면서 실험하고, 진정한 복제를 할 수 있습니다.
이 마이크로 타이 터 플레이트 형식은 쉽게 같은 실험 다양한 질문에 대한 적응 : 박테리아가 조류 호스트와 공생 중성 또는 병원성 상호 작용을해야합니까? 조류의 복합 자극의 추가 또는 독성인가? 이들 및 다른 문제는이 새로운 포맷을 사용하여 9-11 빠른 높은 처리량 방법으로 해결할 수있다.
48 웰 마이크로 타이 배양 플레이트는 각 1 ㎖를 잘 단일 시간 시점에서 샘플링 독립적 인 실험 장치가 될 수 있습니다. 다양한 매개 변수를 포함하여 1 ml의 볼륨에서 샘플링, 이에 국한되지 수 있습니다 WATER-펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정 (재료 및 장비 표 참조) 1을 사용 엽록소 형광 및 광 화학적 매개 변수3. WATER-PAM의 형광 측정 조류 13의 실험을 모니터링하는 데 사용할 수있는 신속하고 비 침습적 방법이다. 14, 15 (WATER-PAM 4 ml의 볼륨 - - 2 중간에 희석 문화의 300 μL 150) 그것은 작은 문화 볼륨에서 광합성 효율과 광계 건강을 측정 할 수 있습니다. WATER-PAM의 형광 측정에 더하여,이 설정을 포함한 다른 다양한 파라미터를 측정하는데 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 : 조류 세포 및 조류 세포 형태의 변화에 부착 된 박테리아를 시각화하는 현미경; 단위 (CFU) 수를 형성하는 박테리아 식민지; 및 조류 세포 수 및 식별 주민들을위한 유동 세포 계측법.
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프로토콜
실험 설정 1. 계산
- 조류 및 / 또는 식 1을 사용하여, 전체 실험에 필요한 제어 될 필요 세균 배양의 체적을 계산한다 :
Y 및 Z는 일 당 필요한 컨트롤 수와 동일한 경우 일 수 같다. - 수학 식 2을 사용하여 실험을위한 공동 배양에 필요한 조류 및 / 또는 세균 배양의 체적을 계산한다 :
주 : 모든 화합물의 화면에서 '공존 배양'실험을 대체 할 수있다; 그냥 실험 설계에 맞게 용매 최종 화합물 및 조류 농도를 조정합니다. - 조기-지수 조류 문화의 최종 부피를 계산하기 위해 식 (1), (2)를 사용 (일반적으로 오일 ~ 104 세포 / ㎖하지만이 performi에 의해 결정되어야한다(이 책은 식 (3)을 사용하여 단계 2.3)에 필요한 실험에 필요한 NG 조류 성장 곡선) :
- 수학 식 4를 사용하여 (이 볼륨이 단계 4.2 필요) 실험에 필요한 × 104 CFU / ㎖의 세균 배양 (또는 원하는 접종 농도)의 최종 부피를 계산하기 위해 수학 식 1 및 수학 식 2를 사용하여
참고 : 오류를 피펫 팅을 설명하는 단계 1.3 및 1.4에서 추가로 10 ml의 수행되는 모든 시험 사용 (유동 세포 계측법, 예를 들면, 물-PAM을, 현미경 등) 0 D에. 실험 설계에 맞게 필요한 경우이 볼륨을 높입니다.
참고 : 8 일 실험의 예 계산 섹션 (10)을 참조하십시오 미디어 조리법에 대한 보충 표를 참조하십시오.
실험 설정 2. 성장 조류 세포
- 격리 또는를 얻을 수적극적으로 무균 조류 문화를 성장.
- 무균 전송 한 보장 멸균 조류 매체 (예를 들어, L1 또는 유사한 해양 조류 매체, 재료 및 장비 표 참조)에 조류 문화의 최종 부피의 10 %, : 신선한 배지에서 조류 문화의 9 희석. 그 변형에 대해 이전에 결정 성장 조건을 사용하여 낮의 인큐베이터에서 희석 된 조류 성장 (예를 들면, 16와 18 °의 C : 8 시간의 빛 : 어두운주기는 일반적으로 사용된다).
- 조류의 최종 부피가 있음 9 희석 : 배양 초기의 지수의 위상, 재 - 배양에 도달하면 동일한 균 조류 배지에서 조류 (예를 들어, L1 또는 유사한 해양 조류 배지)를, 최종 농도가 1 확보 계산 된 V의 A (1.3 단계)과 동일.
참고 : 이러한 문화가 무균되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. (일반 해양 세균 매체에 예를 들면, 해양을 20 μL 나누어지는 도금에 의한 오염에 대한 모든 조류 미디어 및 조류 재고 병 테스트국물 2216 1.5 % 한천 또는 이와 유사한 것)을 보충. - 초기 지수 단계 (~ 104 세포 / ㎖)에 조류 문화를 성장.
주 : 모든 조류 균주 배양 조건에 따라 고유 한 성장 곡선을 갖는다. 조기 지수 상 (~ / ㎖ × 104 세포) (즉, 유동 세포 계측법 또는 현미경을 이용하여) 셀 밀도에 기초 조류 성장 곡선을 수행함으로써 결정될 수있다.
3. 예방 접종에 대한 박테리아 세포를 준비
- (선택된 세균 배지 및 성장 조건에서 성장 곡선을 수행하여 정지상에서 세균의 세균 농도 (CFU / ml) 및 광학 밀도 (OD)를 미리 결정할 예, 25 ° C, 160 rpm에서 2216 해양 국물 ) 또는 유사한. 단계 3.7에서 제대로 세포를 희석 나중에 세포 (단계 3.3) 성장이 정보를 사용합니다.
- 무균는 예를 들어 1.5 % 한천 플레이트 (2216 유연한 해양 국물에서 고립과 갓 재배 세균 식민지를 전송예를 들어 박테리아 액체 배지 (5 ㎖에 1.5 % 한천 또는 유사한 해양 세균 고체 배지)과 그 취지에, 해양 국물 2216 또는 유사한 해양 세균 중).
- (- 박테리아에 따라 36 시간 ~ 12) 롤링 드럼 또는 통에 고정 단계로 박테리아를 성장. 조류 세포는 초기 지수 적 단계 (~ 10 4 세포 / ml)에 도달했는지를 동시에 - 세균 정지상 (109 CFU / ㎖ ~ 108)에 도달되도록 실험을 계획한다.
- 피펫을 사용하여 매체에 테스트 튜브에 부착 된 생물막을 씻는다. 피펫 멸균 1.5 ml의 마이크로 튜브로 잘 혼합 된 세균 배양 1 ㎖. 14,000 × g에서 1 분간 원심 분리한다.
- 제거하고 펠렛 (박테리아 세포)를 방해하지 않고 상층 액 (세균 미디어) 폐기하십시오. (펠렛)와 마이크로 튜브에 멸균 조류 미디어 (예를 들어, L1 또는 이와 유사한 것)의 1 ML을 추가합니다. 소용돌이 마이크로 튜브는 조류 미디어에서 펠렛을 재현 탁합니다.
- 두 번째 세척 :단계 3.5를 반복합니다.
참고 :이의 영양 성분을 변경할 수 있기 때문에 철저하게 이전에 그들과 함께 조류를 접종에 세포에서 세균 미디어, 세포 암 설, 배설 단백질과 작은 분자를 모두 제거하기 위해 조류 매체를 사용하여 박테리아 세포를 세척하는 것이 중요합니다 조류 미디어가 화면에 생리 활성 분자를 도입하거나. - 직렬 원하는 최종 박테리아 농도 (CFU / ㎖)보다 더 농축 된 100 배이다 최종 농도, 조류 매체 세정 균체를 희석. 단계 4.2 조류 미디어 세척 및 희석 된 세포를 포함하는 마이크로 튜브를 저장합니다.
주 : 0 D에 세균 조류 : 1 비율을 갖는 하나에 기초하여 상기 실험을 계획한다. 단계 3.7에서 초기 셀이 직렬로 10 6 CFU / ㎖로 희석해야하므로 실험이 원하는 초기 세균 농도를 수행하려면, 10 4 CFU / ㎖이다.
실험 4. 준비 박테리아알 설정
- 4 멸균 멸균 유리 삼각 플라스크를 준비하고 레이블 :) '조류 제어 플라스크', b)는 '희석 박테리아 스톡 플라스크', C) '세균 제어 플라스크', 및 d) '공동 문화 플라스크를'.
- 에서 세균 현탁액을 희석 최종 부피 = V B (단계 1.4)에 멸균 조류 미디어 3.7 1:99 단계. 플라스크에 표시된 희석 세균 재고 (단계 4.1)에 희석합니다.
참고 : 위의 예 (단계 4.2),이 1:99 희석 × 104 CFU / ㎖의 최종 농도를 제공한다. 소용돌이 플라스크에 세포를 혼합합니다. - 피펫 V 제어 희석 세균 주식에서 (1.1 단계) 및 세균 제어 플라스크에 넣어.
- 세균 제어 플라스크에 넣고 멸균 조류 매체의 피펫 V 제어 (이것은 1 : 1 희석). 소용돌이 플라스크에 세포를 혼합 단계 7.3 따로 설정합니다.
- 희석 세균 주식에서 피펫 V는 공동 문화단계 6.1 따로 플라스크를 설정, 공동 문화 플라스크에 플라스크.
참고 : 한 번에 같은 조류에 다수의 공동 문화를 수행 할 때이 개별적으로 각 변형에 대한 V 공동 문화를 다시 계산하고 다음 단계를 반복 할 필요가있다 (즉, 두 개의 서로 다른 박테리아의 공동 문화는 하나의 제어와 분리) 개별적으로 각각의 공동 문화 4.5. 이것은 수학 식 5에 도시 된 공동 배양 모두를 포함하도록 단계 130에서 산출 된 V를 증가시키는 것도 필요하다 :
실험 설정을위한 조류를 준비 5.
- 세포가 잘 혼합 나타날 때까지 조심스럽게 넓은 입 피펫 팁 (2.4 단계)에서 초기 지수 조류 문화를 섞는다.
- 조류 제어 플라스크에 조류 스톡 병에서 피펫 V 제어 할 수 있습니다. 부드럽게 10ml를 피펫을 사용하여 피펫. 그리고 낮의 인큐베이터에서 조류 재고 병을 반환합니다.
- 피펫 V의 계속조류 제어 플라스크에 멸균 조류 매체의 ROL (이것은 1 : 1 희석). 단계 7.4 필요한 때까지, 낮의 인큐베이터에서 술병과 장소를 섞어 소용돌이.
6. 준비 실험 공동 문화
- 부드럽게 4.5 단계에서 세균 공동 문화 플라스크에 조류 재고 플라스크 V의 공동 문화를 피펫. 단계 7.5 필요한 때까지 낮의 인큐베이터에 공동 문화 플라스크를 돌려줍니다.
주 : 세균 제어 세균의 농도는 실험 공동 문화의 세균 농도와 같아야합니다. 마찬가지로, 조류 제어 조류의 농도는 실험 공존 배양에서 조류의 농도와 동일해야한다. 동일한 초기 박테리아 및 조류의 농도를 가짐으로써, 인구 밀도는 실험 내내 비교 될 수있다.
7. 미세 적정 플레이트 설정
- 도 1에 따라 멸균 48- 웰 마이크로 타이 터 플레이트를 나눈다.멸균 희석제 또는 비 광합성 중 샘플을 포함하는 외부 우물 위의 레이블.
참고 : 판 우물의 무작위 같은 날에 찍은 샘플을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 제 1 사분면은 실험에서 D로 샘플링 한 것이다; 도 4 및 C2 - -도 1에 나타낸 바와 같이 4 멸균 용액으로 충전 플레이트의 경계를 남겨 무작위되어야 웰 B2이다.
. 다음 48- 웰 마이크로 타이 터 플레이트 웰에 샘플 배치 그림 1. 개략도 채워지 : 컬럼 1, 6, F를 통해 웰 ( 
)) PBS (또는 다른 멸균 솔루션 / 미디어 1X 1 ㎖로 채워집니다. 행 및 F, 우물 2-8 ( 
) 1 ml의 세균 제어로 가득; ROWS B와 E 우물 2-8 ( 
) 1 ml의 조류 제어로 가득; 행 C와 D, 우물 2-8 ( 
) 1 ml의 공동 문화로 채워져있다. 네,이 판에 걸쳐 무작위 따라 표시되어야합니다 - 판은 4 사분면 (A2, A5, D2 및 D5)이 사분면 (1) 각각의 특정 샘플링 시절로 나누어진다. 매일 내에서 우리는 조류 제어 (랜덤 조언한다 
)와 공동 문화 ( 
난수 발생기를 사용하여) 웰. 조류 문화의 음영을 방지하기 위해 1X PBS 및 / 또는 세균 제어 우물 위에 뚜껑을 레이블.
- 피펫 1ml의 1X 인산 완충 용액 (PBS, pH를 7.4) 또는도 1에 나타낸 바와 같이 다른 적절한 웰 멸균 용액. 천천히주의하여 수행. PBS 것 짱GE의 조류 및 / 또는 공동 문화 매체의 이온 강도가 다른 우물이 너무 신중하게 처리에 뿌려 놓은합니다.
- 피펫의 우물에 세균 제어 문화 1 ml의 세균 제어 (그림 1) 표시. 세균 침전을 방지하기 위해 각 플레이트 피펫 팅 전에 세균 플라스크를 소용돌이.
- 피펫 한 넓은 입 피펫 팁 (그림 1)를 사용하여 조류 제어를 표시 우물에 조류 제어 문화 ml의. 세균 플라스크처럼 정기적으로 조류 플라스크를 소용돌이. 조류 싱크 또는 부유하는 경향이 경우 시각적으로 균일 한 문화를 유지하기 위해 필요할 때, 규칙적으로 소용돌이 친다.
- 넓은 입 피펫 팁, 피펫 적절한 우물에 공동 문화의 1 ㎖ (그림 1)를 사용. 조류 플라스크처럼 정기적으로 공동 문화 플라스크 소용돌이.
- 원하는 온도와 낮의 빛을주기에 낮의 인큐베이터에서 파라 필름 및 장소 각 플레이트를 밀봉 (8 시간 등 16 : 18 ° C 어두운 사이클이 일반적으로 사용된다). 휴가준비가 될 때까지 낮의 인큐베이터에있는 플레이트는 PAM 판독 (8 항) 촬영합니다. 모든 플레이트를 확인 일관된 노광을 허용하기 위해 동일한 방향으로 배향된다.
- PBS, 조류 미디어, 조류 재고 및 조류 제어에서 20 μL 나누어지는을 가지고 적절한 비 선택적 매체에 판을 드롭 (예를 들면, 1.5 % 한천로 보충 해양 국물 2216)과 18 판을 품다 - 72 25 ° C 시간은 오염 테스트합니다. 성장이 박테리아를 포함 할 수 없습니다 솔루션 중 하나에 표시되면, 이러한 데이터는 사용할 수 없습니다.
- 읽기 실험 0 D의 PAM의 형광 측정 (단계 8.1 참조) 조류 제어 및 공동 문화 플라스크에 남아있는 샘플을 사용 PAM 형광 측정 수치를 가져 가라. 다른 0 D 측정은 또한 남은 제어 조류, 박테리아 제어 및 공동 배양 된 샘플로 수행되어야한다.
주식 샘플 8. 촬영 PAM 형광 측정 수치
- WATER-PAM 제로판독 8 복용하기 전에 깨끗한 큐벳에 멸균 조류 미디어.
- 피펫 실험에 사용 된 동일한 매체 조류 2.7㎖를 함유하는 깨끗한 큐벳 조류 제어 또는 공 배양 플라스크에서 300 μL. 넓은 입 피펫 팁으로 부드럽게 시료와 희석액을 혼합.
- 와이프 - 오프 티슈로 큐벳 외부에서 모든 지문을 물-PAM에 큐벳을 배치하기 전에.
- WATER-PAM에 큐벳을 놓습니다. 캡으로 샘플을 커버하고 3 분 동안 어두운 적용 할 수 있습니다. 암순응 시간은 조류의 종류에 따라 다양하며, 실험에 사용 된 특정 조류에 대해 결정되어야한다. 조류 낮의 인큐베이터 16, 17의 어두운주기의 중간 동안 물-PAM 판독을 복용하여 긴 어두운 적응 시간 (> 20 분)하지 마십시오.
- 어두운 적응 한 후, F 0 버튼을 누르십시오. 1 조류 매체 : 형광 측정 값이 3,900 이상일 경우, 샘플 1을 희석. 추가로 3 분 탁에 대한 어두운 적응EA의 새로운 독서. F 0 F m 수치가 3900 이하가 될 때까지 조류 매체에 1 : F 0 F m 수치가 3,900 이상 계속 경우, 샘플 1을 희석하는 것을 계속한다.
참고 : 조류 샘플 1 희석되는 경우, 예를 들면 : 최종 형광을 기록 할 때이 희석을 설명 할 수 있는지 확인 희석 관 우물에서 초기 전송하는 동안 9, 500의 조류 형광 판독 역 곱해야합니다 희석 배수와 튜브의 실제 형광 (이 경우 10 년) 후 5000이다. - F 0을 설정 한 후, F의 m 판독을 적용하려면 SAT 버튼을 눌렀을 때마다 90 초를 읽고 포화 펄스 (SAT 펄스) 걸릴. 판독 값 사이의 시간 간격은 조류 균주에 따라 조정될 수있다. 폐기 샘플.
- 나머지 샘플 8.6 - 반복 8.1 단계를 반복합니다.
미세 적정 플레이트 9. 촬영 PAM 형광 측정 수치
- 상표조류 제어 및 우물 C2 4 - - 박테리아의 공동 문화 4 (그림 1의 플레이트 레이아웃 참조) 우물 B2에 대한> 3 ㎖ 볼륨의 6 멸균 샘플 튜브.
- 각 튜브에 분취 조류 멸균 배지 2.7㎖를.
- 낮의 인큐베이터에서 튜브를 삽입하고 그들에게 조류가 30 분에서 성장 온도에 적응 할 수 있습니다.
- 인큐베이터에서 마이크로 타이 터 플레이트를 제거하기 전에 적극적으로 희석 튜브 우물에서 문화를 전송하는 동안, 9.5 단계 (호일을 제거 알루미늄 호일 (또는 유사)와 플레이트를 커버에 의해 제한됩니다 어두운 적응 우물에 빛 침투를 보장 - 9.7).
- 무균는 천천히 피펫 아래로 넓은 입 피펫 팁 (물론 B2) 잘 최초의 마이크로 타이 터 플레이트를 섞는다.
- (넓은 입 피펫 팁과 해당 샘플 튜브에 300 ㎕를 잘 B2 (그림 1)에서 인큐베이터 및 무균 양도 희석 튜브를 얻습니다조류 매체 샘플)의 희석 9 : 1이된다.
- 나머지 우물 용 9.6 (B3,4 및 C2 - - 4)를 반복 9.5 단계를 반복합니다.
- 알루미늄 호일로 샘플 튜브를 덮고 물-PAM에 대한 준비가 될 때까지 낮의 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 8.7 - 8.1 단계에 설명 된대로 WATER-PAM 읽기를 수행합니다. 인큐베이터에 반환하기 전에 파라 필름과 마이크로 타이 터 플레이트를 밀봉합니다.
- 실험 기간 동안 계획된 시간 간격으로 측정 값을 반복합니다. 주파수 및 샘플링 기간은 실험의 시작 계획한다.
10. 샘플 실험
샘플 실험은 박테리아 (Phaeobacter의 gallaeciensis의 BS107)와 microalga (인 Emiliania huxleyi 변형 (CCMP3266))의 10 일 공동 문화입니다. 그것은 조류 제어, 세균 제어 및 세균 - 조류 실험 공동 문화를 포함한다.
- 1 단계 (필수 박테리아 및 조류 주식의 볼륨을 계산합니다.1-1.4)
- 36 ml의 배지에서 조류 4㎖를 접종하여, 조류 스톡, 40 ml의 V를 준비하고 초기 지수 적 성장 ~ 104 세포 / ㎖ (2.1 단계 - 2.4)의 셀 밀도가 달성 될 때까지 배양 하였다.
- (10 4 CFU / ㎖ 될 것이다 박테리아의 최종 농도) 조류 미디어 40 ml의 V B로 3 절에서 얻은 10 6 CFU / ㎖의 세균 400 μl를 희석하여 세균 재고 플라스크를 준비합니다.
- 전송 제어 세균 플라스크 세균 스톡의 절반 (20 ㎖) 및 세균을 제어하기 위해 매체 조류 20 ㎖를 추가한다. 전송 절반 (20 ㎖) 조류 조류 제어 플라스크에 주식과 조류 제어 (5 장)을 만들기 위해 조류 미디어 20 ㎖를 추가합니다. 공 배양을 설정하는 공동 배양 플라스크 세균 콘텐츠의 나머지 20 mL로 옮기고 조류 콘텐츠의 나머지 20 ㎖로 혼합 (섹션6).
- 두 미리 라벨링 미세 적정 플레이트 (도 1), 웰 당 1 ㎖의 1X PBS (PH 7.4), 제어 장치 및 공동 배양 피펫. 0 D 측정 (CFU 수, WATER-PAM (8), 조류 세포 형태의 현미경 관찰 및 유동 세포 계측법에 대한 조류의 세포 고정)를 만들기 위해 나머지 컨트롤 및 공동 문화의 3 ㎖를 사용합니다.
- 0 D의 측정 (8 항) 찍은과 동시에 항상 10 D를위한 하루에 한 번 조류 제어 및 공동 문화 WATER-PAM 판독 값을 가지고,.
관심 11. 기타 매개 변수
- 세균 CFU 농도를 결정 멸균 1X PBS (또는 유사)에서 세균 제어 및 공동 문화의 일련의 희석을 수행 한 후 1.5 % 한천 (또는 유사)로 보충 해양 국물 2216에 판을 드롭하고 성장 CFU의 수를 관찰 각 웰 (18)에 대한 세균 CFU / ㎖를 확인합니다.
- 조류 세포 농도를 평가하기 : 조류 제어 및 공동 해결글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 0.15 %에 최종 농도와 문화. -80 ° C에서 10 액체 질소에 어두운, 다음 플래시 동결에 분하고, 가게를 품어. 프로세스 흐름 세포 계수기 (FACS 팩스 칼리버 또는 이와 유사한 것)에 대한 모든 샘플은 조류 세포를 계산합니다.
- 조류 문화와 현미경 (즉, 광학 현미경, 표면 형광 또는 유사한)를 사용하여 세균-조류 공동 문화 : 조류의 세포 형태를 관찰한다.
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결과
WATER-PAM의 형광 측정 수치.
물 - 펄스 진폭 변조 (PAM) 형광 측정은 형광 (엽록소 콘텐츠에 대한 프록시) 및 조류 문화의 광합성 수율 (PSII 건강)를 결정하는 빠르고 효율적인 방법입니다. PAM WinControl 소프트웨어는 원시 데이터 값의 스프레드 시트 (다음 어두운 적응 조류 시료 기본적인 파라미터이다)를 생성한다 :
어두운 적응 세포의 F 0 = 형광
F의 m = 최대 형광 발광 다이오드 포화 후 (LED) 펄스
어두운 적응 샘플 (19)의 F의 V / F의 m = (F m에 -F 0) / F의 m은 = 잠재적 인 양자 수율
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토론
소형 형식으로 조류 성장.
현재 실험에서 복제가 증가 될 수 있도록 마이크로 타이 터 플레이트에서 1ml의 배양 부피 조류 배양의 소형화를 허용한다. 이 녹조류는 실험 내내 건강 보장하는 것이 중요하다; 조류의 영양 요건이 충족 될 수 있도록, 다양한 조류 매체를 평가하기 위해 마이크로 타이 터 플레이트 포맷을 사용하여, 성장 곡선 (도 2)를 수행한다. 또한,이주기 일주 (명암주기)과 온도를 최적화하는 것이 중요 할 수있다. 주어진 조류에 대한 적절한 최적화는 26 D에 대한 피크 형광에서 건강한 조류 문화를 유지하고 1백40일 (그림 2) 후 잠재적 인 양자 수율을 검출 할 수 있습니다.
증발 효과를 최소화.
그것은 "에지 효과"뿐만 액체 기재 분석법의 증발 효과를 최소화하는 것이 중요하다 O 일반적bs...
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공개 사항
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감사의 글
이 작업은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(보조금 402105), 캐나다 혁신 재단(보조금 129087) 및 앨버타 교육 및 훈련(보조금 AAETRCP-12-026-SEG)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 cu. ft. 일주일 인큐베이터 (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, 벤트/클로즈 캡, 7 ml 작업 용량, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340www.fishersci.ca | |
| 멀티웰 TC 플레이트 – 48-웰 | BD Biosciences 디스커버리 랩웨어 | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson 피펫팅 표준— Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson 피펫팅 표준— Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide 오리피스 팁 비멸균 [100– 1,250 &마이크로; l] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips 비멸균 [100– 1,250 &마이크로; l] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151www.fishersci.ca | |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm 직경 석영 유리 큐벳 (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| 염화나트륨 (결정질/ACS 인증), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 미디엄 키트, 50 L | NCMA [국립 해양 조류 및 미생물군 센터 | NCMA [국립 해양 조류 및 미생물군 센터 | www.ncma.bigelow.org |
참고문헌
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