세포외 도파민(DA)의 급격한 변동은 포유류의 보상 처리와 동기 부여 행동을 모두 중재합니다. 이 원고는 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐에서 타스탄트가 빠른 도파민 방출을 어떻게 변경하는지 결정하기 위해 FSCV(Fast Scan Cyclic Volammetry)와 구강 내 타스탄트 투여의 조합을 설명합니다.
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방법 논문
깨어 쥐의 구강 내 Tastant 관리하는 동안 빠른 스캔 순환 전압 전류 법으로 빠른 도파민 역학 시험
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
포유류의 뇌에서 빠르게, 위상 도파민(DA) 방출은 보상 처리, 강화 학습 및 동기 부여 제어에 중요한 역할을 합니다. FSCV(Fast Scan Cyclic voltammetry)는 여러 유형의 제제에서 위상 DA 방출을 검사하는 데 사용되는 높은 공간 및 시간(초 미만) 해상도를 가진 전기화학 기술입니다. 단세포 및 뇌 절편에 대한 시험관 내 실험과 마취된 설치류에 대한 생체 내 실험은 정상적인 조건과 질병 모델에서 도파민 방출 및 흡수를 매개하는 메커니즘을 확인하는 데 사용되었습니다. 지난 20년 동안 깨어 있고 자유롭게 움직이는 설치류를 대상으로 한 생체 내 FSCV 실험은 보상 처리 및 보상 학습에서 도파민 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다. 깨어 있고 자유롭게 움직이는 준비의 주요 장점 중 하나는 특정 행동 이벤트나 보상 또는 신호 프레젠테이션에 시간이 고정된 빠른 DA 변동을 조사할 수 있는 능력입니다. 그러나 행동과 전압전류법 실험을 결합한 것의 한 가지 한계는 1차 보상 또는 혐오적 자극에 특이적인 DA 효과를 보상 지향적 또는 기타 운동 행동을 매개하는 동시에 발생하는 DA 변동과 분리하기 어렵다는 것입니다. 여기에서는 깨어 있는 쥐에서 생체 내 FSCV와 구강 내 주입을 사용하여 구강 타구에 대한 DA 반응을 직접 조사하는 결합 방법을 설명합니다. 이 실험에서는 구강 타스탄트를 쥐의 입맛에 직접 주입하여 보상 지향적 행동과 자발적인 음주 행동을 우회하여 타스탄트 자극에 대한 DA 반응을 직접 조사할 수 있습니다.
서론
Phasic DA release는 보상 지향 행동을 중재하는 데 중요한 역할을 합니다[1-3]. 그러나 1차 보상이 위상적 DA 방출을 어떻게 변화시키는지 분리하고 연구하는 것은 종종 위상적 DA 방출을 변경할 수 있는 동시 발생 행동 또는 인지 프로세스(예: 보상을 획득하기 위한 의사 결정 과정 또는 보상 지향 운동 행동)로 인해 복잡합니다. 현재 연구에서는 구강 내 캐뉼러를 통한 타스탄트 전달과 결합된 생체 내 고속 스캔 순환 전압전류법(FSCV)을 사용하여 타스탄트에 대한 위상 DA 반응을 분리합니다. 이 기술은 선택과 행동을 우회하고 쥐의 입천장에 타스탄트를 직접 주입하는 동안 세포 외 DA 방출을 검사할 수 있습니다.
FSCV는 시간 및 공간 분해능이 높은 전기화학 기술로, 초 미만의 스케일(10Hz 분해능)로 개별 국소 영역(약 100μm)에서 DA 방출을 측정할 수 있습니다. 구강 내 전달과 FSCV의 조합은 기존의 미세 투석 방법으로는 검사할 수 없는 타탄트에 대한 빠른 '실시간' DA 반응을 관찰할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한, 보상 또는 보상 관련 신호에 대한 응답으로 위상 DA 방출은 20-100nM 사이의 농도에서 발생하며, 이는 FSCV에 대한 10-20nM 검출 임계값보다 높습....
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프로토콜
모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 (NIH) 가이드의 국립 연구소에 따라 수행하고, 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1) 수술 전 준비
- 구강 솔루션 준비
- 10 % 자당과 탈 이온수에 0.005 %의 L - 멘톨 (PH 7.4)의 솔루션을 만듭니다. 실온에서, 밀폐 용기에이 솔루션을 저장하고 저하를 방지하기 위해 2 주마다 리메이크.
- 전극 보정 용액
- 교정하기 전 언제든지 트리스 완충액 (pH 7.4)을 확인. 이 솔루션은 12.0 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 3.25 mM의 KCl을, 1.20 mM의 CaCl2를, 1.25 mM의 NaH2PO4, 1.20 mM의의 MgCl 2, 2.00 mM의 나 2 SO 4로 구성되어 있습니다.
- 0.1 M 과염소산에서 10 mM의 도파민 (도파민 염산염 DA)의 원액을 만듭니다. 과염소산은 dopamin의 산화를 방지하는 데 도움이전자. -20 ° C에서이 원액을 저장하고 최대 6 개월 동안 사용합니다. 한 번만 각 나누어지는을 사용하려면 저장을 위해 다 원액의....
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결과
구강 내 카테터 삽입술과 결합 FSCV 방법 크로스, appetitive tastant을 검사하는 데 사용되었다 NAC 코어에 phasic DA 자료를 변조한다. tastant 주입, 전기 자극하기 전에.; VTA의 (150 μA, 60 Hz에서, 24 펄스 빨간색 막대로 표시)은 그림 1 NAC (그림 1)에서 phasic 다 릴리스의 강력한 증가를 생산 잠재력을 가진 컬러 플롯을 보여줍니다 Z 축의 Y 축, X 축에 시간 및 전류 (거짓 색으로 표시). 색상 플롯 아래 시간 추적 대 DA 농도이다. 시간에 대한 농도는 도파민의 산화 전위에서 전류 대 시간 추적을 사용하여 측정 하였다 전극의 교정 후 다음과 같은 농도로 전환시켰다 (점선 흰색 선으로 표시). 시간 추적이 DA 대 농도는 PCA에 설정된 훈련의 일부로서 사용되었다.
자당의 훈련 세트를 획득 한 후, 25 주입(10 %, 주입 당 200 μL)을 매 .......
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토론
FSCV과 함께 구강 tastant 배달 구강 향미를 "실시간"다 응답의 분석을 허용한다. 성공적인 DA 측정에 필요한 프로토콜의 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 구강 카테터의 적절한 주입은 향미의 전달을 위해 중요하다. 카테터는 제 1 대구치 뒤에 삽입하고 제자리에 쐐기되는 것을 보장하는 것은 개통을 잃지 카테터를 방지하고 동물에 의해 실수로 삭제되는 것을 방지 할 수 있습니다. 복구 후 처음 며칠 동안 카테터를 플러싱하는 제 2 또는 3 일 동안 동물에게 주어진 소프트 음식 수술 후는 카테터를 방해 할 수 있기 때문에, 또한 중요하다. 둘째, 전극의 품질이 자유롭게 움직이는 랫트에서 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 중요하다. 어떤 경우에는, 시각적으로 표시 전극은 높은 품질과 여전히 잡음 신호를 제공 할 수 있습니다 좋은 조건이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 D에서 기준 기록을하는 것입니다orsal의 선조체 (DURA 아래 4mm). 전극 너무 많은 소음이 발생하는 경우,.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 간행물에 보고된 연구는 NSF 대학원 연구 펠로우십(RJW)과 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 및 FDA 담배 제품 센터(CTP)의 약물 남용 연구소(P50DA036151 National Institute on Drug Abuse)의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자극 전극 | 플라스틱원 | MS303/2-A/SPC | 주문 시, 페데스탈 하단 22mm 절단을 요청하십시오. |
| 전극용 캐뉼라 | 바이오 분석 시스템 | MD-2251 | |
| 유리 모세관 | A-M 시스템 | 624503 | |
| 탄소 섬유 | 쏜넬 | T650 | |
| 전극 인출기 | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog 자극 절연기 |  Digitimer Ltd. | DS4 | |
| 열수축 튜브 | 3M | FP-301 | |
| 전극용 절연 전선 | Squires 전자 기기 | 맞춤형 | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| 마이크로매니퓰레이터 | 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스, 공학 기계 작업장 | ||
| 에폭시 | ITW Devcon | 14250 | 5분 경화 에폭시 |
| 퍼플루오로-3,6-디옥사-4-메틸-7-옥텐-술폰산과 테트라플루오로에틸렌의 공중합체 | 이온 전력 | LQ-1105 | 즉, 나피온(Nafion) |
| 은 페인트 | GC 전자 장치 | 22-023 | |
| 전원 공급 장치 | BK Precision | 9110 | |
| 구강 내 카테터용 튜빙 | 인트라메딕 | 427426 | PE 100, 내경(I.D.) = 0.86 mm; 외경(O.D.) = 1.52 mm |
| 구강 내 주입용 튜브 | Fischer Scientific | 02-587-1A | 내경 1/32"; 외경 3/32" |
| 플로우 셀용 시린지 펌프 | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| 수술용 시멘트 | Dentsply Caulk | 675571 및 675572 | |
| 공압 액추에이터 | VICI | A60 | 6포지션 디지털 밸브 인터페이스 |
| 디지털 밸브 인터페이스 | VICI | DVI | 230 VAC |
| 쿼드 헤드스테이지 | 노스캐롤라이나 대학교, 전자시설 | ||
| UEI 전원 공급 장치 | 노스캐롤라이나 대학교, 전자 시설 | ||
| UEI 브레이크아웃 박스 | 노스캐롤라이나 대학교, 전자시설 | ||
| tastant 시린지 펌프용 전원 공급 장치 | 메드 어소시에이츠(Med Associates) | SG-504 | |
| Tastant 시린지 펌프 | Med Associates | PHM-107 | |
| 텅스텐 미세전극 | 마이크로프로브 | WE30030.5A3 | |
| AgCl 코팅 은선 기준 전극 | InVivo Metric | E255A | |
| 자당 | 시그마 | 80497 | |
| 염화마그네슘 | 시그마 | M8266 | |
| 염화나트륨 | 시그마 | S7653 | |
| 과염소산 | 시그마 | 244252 | |
| 염산 (4 M) | 시그마 | 54435 | |
| 수산화나트륨 | 시그마 | 306576 | |
| 과산화수소 | 시그마 | H1009 | |
| 도파민 염산염 | 시그마 | H8502 | |
| TarHeel HDCV 소프트웨어 | 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 | 소프트웨어 요청 필수: 소프트웨어 요청 페이지 링크를 클릭하십시오 |
참고문헌
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
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