깨어 쥐의 구강 내 Tastant 관리하는 동안 빠른 스캔 순환 전압 전류 법으로 빠른 도파민 역학 시험

요약

세포외 도파민(DA)의 급격한 변동은 포유류의 보상 처리와 동기 부여 행동을 모두 중재합니다. 이 원고는 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐에서 타스탄트가 빠른 도파민 방출을 어떻게 변경하는지 결정하기 위해 FSCV(Fast Scan Cyclic Volammetry)와 구강 내 타스탄트 투여의 조합을 설명합니다.

초록

포유류의 뇌에서 빠르게, 위상 도파민(DA) 방출은 보상 처리, 강화 학습 및 동기 부여 제어에 중요한 역할을 합니다. FSCV(Fast Scan Cyclic voltammetry)는 여러 유형의 제제에서 위상 DA 방출을 검사하는 데 사용되는 높은 공간 및 시간(초 미만) 해상도를 가진 전기화학 기술입니다. 단세포 및 뇌 절편에 대한 시험관 내 실험과 마취된 설치류에 대한 생체 내 실험은 정상적인 조건과 질병 모델에서 도파민 방출 및 흡수를 매개하는 메커니즘을 확인하는 데 사용되었습니다. 지난 20년 동안 깨어 있고 자유롭게 움직이는 설치류를 대상으로 한 생체 내 FSCV 실험은 보상 처리 및 보상 학습에서 도파민 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다. 깨어 있고 자유롭게 움직이는 준비의 주요 장점 중 하나는 특정 행동 이벤트나 보상 또는 신호 프레젠테이션에 시간이 고정된 빠른 DA 변동을 조사할 수 있는 능력입니다. 그러나 행동과 전압전류법 실험을 결합한 것의 한 가지 한계는 1차 보상 또는 혐오적 자극에 특이적인 DA 효과를 보상 지향적 또는 기타 운동 행동을 매개하는 동시에 발생하는 DA 변동과 분리하기 어렵다는 것입니다. 여기에서는 깨어 있는 쥐에서 생체 내 FSCV와 구강 내 주입을 사용하여 구강 타구에 대한 DA 반응을 직접 조사하는 결합 방법을 설명합니다. 이 실험에서는 구강 타스탄트를 쥐의 입맛에 직접 주입하여 보상 지향적 행동과 자발적인 음주 행동을 우회하여 타스탄트 자극에 대한 DA 반응을 직접 조사할 수 있습니다.

서론

Phasic DA release는 보상 지향 행동을 중재하는 데 중요한 역할을 합니다^[1-3]. 그러나 1차 보상이 위상적 DA 방출을 어떻게 변화시키는지 분리하고 연구하는 것은 종종 위상적 DA 방출을 변경할 수 있는 동시 발생 행동 또는 인지 프로세스(예: 보상을 획득하기 위한 의사 결정 과정 또는 보상 지향 운동 행동)로 인해 복잡합니다. 현재 연구에서는 구강 내 캐뉼러를 통한 타스탄트 전달과 결합된 생체 내 고속 스캔 순환 전압전류법(FSCV)을 사용하여 타스탄트에 대한 위상 DA 반응을 분리합니다. 이 기술은 선택과 행동을 우회하고 쥐의 입천장에 타스탄트를 직접 주입하는 동안 세포 외 DA 방출을 검사할 수 있습니다.

FSCV는 시간 및 공간 분해능이 높은 전기화학 기술로, 초 미만의 스케일(10Hz 분해능)로 개별 국소 영역(약 100μm)에서 DA 방출을 측정할 수 있습니다. 구강 내 전달과 FSCV의 조합은 기존의 미세 투석 방법으로는 검사할 수 없는 타탄트에 대한 빠른 '실시간' DA 반응을 관찰할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한, 보상 또는 보상 관련 신호에 대한 응답으로 위상 DA 방출은 20-100nM 사이의 농도에서 발생하며, 이는 FSCV에 대한 10-20nM 검출 임계값보다 높습니다^[4]. FSCV의 높은 공간 해상도는 또한 측좌핵(NAc)과 같은 작은 뇌 영역의 하위 영역에서 기록할 수 있습니다. 따라서 tastants의 구강 내 주입과 결합된 FSCV는 깨어 있고 행동하는 동물에서 tastants 또는 기타 자극이 위상 DA 방출을 어떻게 변경하는지 연구하는 데 이상적인 모델입니다. 실제로, 이러한 기술은 보상과 혐오감이 어떻게 세포외 DA 방출을 변화시키는지 조사하는 실험을 가능하게 했습니다^[5].

지난 10년 동안 FSCV 분석은 약물 중독 모델에서 위상 DA 메커니즘의 역할을 확인하기 위해 정맥 주사 약물 전달^[6] 및 쥐 자가 투여 패러다임^{[7, 8]}과 성공적으로 결합되었습니다. 또한, 코카인 가용성과 짝을 이루는 구강 내 전달이 어떻게 위상적 DA 방출 및 정서적 영향을 반영하는 행동 반응을 조절하는지 조사하기 위해 FSCV와 결합된 구강 내 전달이 사용되었습니다^[3]. 이 결합된 구강 내 및 FSCV 방법론은 담배 및 용해성 담배 제품에 첨가되는 멘톨 및 경구 감미료와 같은 향미제에 대한 위상 DA 반응을 조사하는 데에도 강력하게 활용될 수 있습니다^[9-11]. 담배 제품에 첨가된 많은 향미제가 식욕을 돋우지만^[9-11], 이러한 향미제가 보람 있는 쾌락 원자가와 일치하는 방식으로 위상 DA 방출을 증가시키는지는 알려져 있지 않습니다. 실제로, 담배 및 용해성 담배 제품에 첨가된 향미제는 DA 보상 시스템에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며 도파민 메커니즘을 통해 작용하여 담배 및 기타 담배 제품의 보상 원자가에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 FSCV와 결합된 구강 내 전달은 향미제가 빠른 DA 방출을 조절하는 방법에 대한 새로운 이해를 제공할 수 있습니다. 구강 내 및 생체 내 FSCV 방법론을 결합한 사용과 이러한 연구에서 얻은 데이터는 향료와 니코틴이 어떻게 상호 작용하여 DA 신호를 변경하고 잠재적으로 니코틴 강화를 조절하는지 결정하기 위한 향후 연구를 촉진할 수도 있습니다. 또한, 이러한 연구에서 얻은 데이터는 담배 제품 향료에 대한 규제 결정을 알리는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 (NIH) 가이드의 국립 연구소에 따라 수행하고, 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1) 수술 전 준비

1. 구강 솔루션 준비
   1. 10 % 자당과 탈 이온수에 0.005 %의 L - 멘톨 (PH 7.4)의 솔루션을 만듭니다. 실온에서, 밀폐 용기에이 솔루션을 저장하고 저하를 방지하기 위해 2 주마다 리메이크.
2. 전극 보정 ​​용액
   1. 교정하기 전 언제든지 트리스 완충액 (pH 7.4)을 확인. 이 솔루션은 12.0 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 3.25 mM의 KCl을, 1.20 mM의 CaCl2를, 1.25 mM의 NaH2PO4, 1.20 mM의의 MgCl _2, 2.00 mM의 나 ₂ SO _4로 구성되어 있습니다.
   2. 0.1 M 과염소산에서 10 mM의 도파민 (도파민 염산염 DA)의 원액을 만듭니다. 과염소산은 dopamin의 산화를 방지하는 데 도움이전자. -20 ° C에서이 원액을 저장하고 최대 6 개월 동안 사용합니다. 한 번만 각 나누어지는을 사용하려면 저장을 위해 다 원액의 여러 분취 량을 확인합니다.
   3. 10 mM의 다 재고, 1 ㎛, 500 nm의, 250 nm의, 125 nm의, 62.5 nm의, 및 31.25 nM의 농도에 트리스 버퍼 솔루션을 희석.
   4. pH 보정을 위해, 트리스의 솔루션은 7.2, 7.3, 7.5, 7.6의 pH와 버퍼를 준비합니다. 이 생체 실험 중 발생할 수의 pH 변화를 모방 솔루션을 제공 할 것입니다.
3. 전극 제조
   1. 진공 흡인 (직경 0.4 mm 내부에 길이 10mm, 외경 0.6 mm) 보로 실리케이트 유리 모세관에 T-650의 탄소 섬유 (7 μm의 직경) 대기음.
   2. 수직 전극 풀러에 탄소 섬유로 채워진 유리 모세관을 놓습니다. 초기 매개 변수의 경우, 55.0에 히터를 설정하고 자석을 끕니다. 히터 및 자기 설정 둘 다를 FR 그러나, 상기 최적화는 필요할 수도실험실에 옴 실험실.
      참고 : 전극이 쉽게 미세 조작기에 적합하고 쥐의 뇌 경질보다 적어도 6.9 mm를 삽입 할 수 있도록 (테이퍼 포함) 적어도 5.5 ㎝ 길이이어야한다. 전극이 너무 짧으면, 중격 의지 핵의 복부 부분으로부터 기록은 달성되지 않을 것이다. 한편, 전체 전극 길이는 미세 조작기에 너무 길어 것이다 그렇지 6.5 cm를 초과하지 않아야한다.
   3. 이 유리의 단부 너머 75-100 μm의 연장되도록 광학 현미경을 사용하여, 노출 된 탄소 섬유를 잘라. 전극이 연속 촬영시 최소한의 노이즈가 발생합니다 유리 전극과 탄소 섬유 사이의 아주 꽉, 겨우 식별, 인감을 가지고 있는지 확인합니다. 가난한 실 나타내는 유리 또는 실이 느슨하면 눈에 띄는 균열이있을 경우 전극을 폐기하십시오. 더 자세한 설명은 [12]과 [13]를 참조하십시오.
4. 마이크에 전극을 조립romanipulator
   1. 와이어의 길이를 따라 절반으로 절연되어 3에 30G 와이어를 구하여 은의 얇은 층이 와이어에 직접 페인트 적용 작은 붓을 사용한다. 즉시 실버 페인트를 도포 한 후, 탄소 섬유의 물리적 및 전기적 접속을 제공하는 전극의 상단에 구멍에 와이어를 삽입한다. 현미경, 은선은 탄소 섬유와 접촉하는 것을 보장한다.
   2. 열 수축을 사용하여 미세 조작기에 실버 와이어 전극을 고정합니다.
   3. 전극 표면을 청소할 도파민 후의 감도를 증가시키기 위해, 적어도 10 분 동안 정제 된 이소 프로필 알코올 (IPA)로 제조 된 탄소 섬유 전극을 배치. IPA에 몸을 담근 후, I​​PA를 제거하기 위해 수돗물로 탄소 섬유 린스.
5. 기준 전극 제조
   1. , 약 6mm AG / AG CL 메쉬 (단독 7mm 실버 와이어, 6mm 메쉬, 0.4 mm 직경)를 포함하는 13mm 실버 와이어를 타고아래쪽 절반 정도 원래 길이 실버 부를 잘라 골드 핀 와이어의 실버 부분 납땜.
   2. 핀에 납땜을 통해 에폭시를 적용합니다.
   3. AG을 담그고 / AG CL 5 % 폴리 테트라 플루오로 에틸렌과의 공중 합체로 최종 메쉬 퍼플 루오로 -3,6- 디 옥사 -4- 메틸 설 7octene 각 DIP간에 30 분간 공기 건조 기간을 가진 산 5 번.
   4. 코팅 AG / AG (CL)은 건조 공기의 O / N에 메쉬 허용합니다.
   5. 1 시간 동안 120 ºC에서 오븐에서 큐어.

2) 결합 구강 외과 및 두개 내 캐 뉼러 수술 (약 75 분)

1. 구강 카테터 제조
   1. 경구 카테터를 확인하고, 적어도 10 일 전에 수술, 산화 에틸렌 멸균 소독.
   2. 6cm 길이 세그먼트로 PE (100) 튜브를 잘라.
   3. 납땜 인두를 사용하여 PE 튜브의 한쪽 끝을 녹여 즉시 PE 튜브를 냉각하기 위하여 고체 표면에 키를 누릅니다. 결과는 만들어야합니다작은 평면 PE 배관의 일단은 디스크 및 플랜지되어서는 안된다. 바늘 (18 G)를 사용하거나 디스크의 중앙에 구멍을 만드는 푸시 핀.
   4. PE 튜브의 다른 쪽 끝에서 꼭 튜브에 18 G 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입합니다.
   5. 표준 용지 홀 펀칭기를 사용하여, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 와셔를 만들 수 (3.18 mm 두께, 직경 6mm) 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 시트의 여러 원형 조각을 펀치.
   6. 세탁기의 중앙에 구멍을 만든다. PE 관에 부착 된 바늘을 가지고 세탁기를 완전히 밀어 넣습니다. 바늘이 통과되면 그것은 세탁기에 대하여 높이가되도록, PE 관의 바닥에 세탁기를 밀어 넣습니다.
2. 구강 외과
   1. (멸균하기 전에 페데스탈 2.5 mm 이하로 트리밍) 수술 도구, 캐 뉼러, 및 참조 전극을 멸균 후 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 쥐를 마취.
      1. AF터 5 분간은 마취의 수준을 평가하는 유해 자극 시험 (발 또는 테일 핀치)를 적용한다. 피사체가 유해 자극 테스트에 물리적 인 반응을 표시하는 경우, (호흡이나 심장 박동에 반응 증가를 움찔) 원래 용량의 15 %에 10 %의 케타민 향상을 관리하고 위의 유해 자극 프로토콜을 반복합니다.
   2. 쥐가 완전히 마취하고 유해한 자극 테스트에 아무런 반응을 보이지 않는다 후, 귀 뒤에 약 2 mm로 눈에서 쥐의 털을 면도 동물 헤어 가위를 사용합니다. 이어서 수술 동안 체온을 유지하기 위해 얇은 물 재순환 가열 패드를 배치 쥐. 눈 윤활제를 적용합니다. 종래 어떤 절개 수행하기 전에 구강 캐 뉼러를 삽입에 복강 내 주사함으로써 비 스테로이드 항염증제 (NSAID) 약물, 카프로 펜 (5 ㎎ / ㎏)을 투여. 항상 무균 기술을 사용합니다.
   3. 피부를 청소하기 위해 70 % 에탄올 다음 betadine을 적용합니다. 3 번 반복합니다.
   4. 괞 찮아그 뒷면에있는 쥐를 CE 및 멸균 면봉을 사용하여 입을 엽니 다. 제 1 상부 몰을 찾아보십시오.
   5. 바늘이 바로 뒤에 종료 될 때까지 뺨과 제 1 상부 몰 사이의 조직에 바늘을 삽입하고 귀에 내측.
   6. 피어스 PE 튜브 때까지 피부를 통해 바늘이 피부를 종료하고 액세스 할 수 있습니다.
   7. (정맥 자체가 아니라 바늘 그립) 캐 뉼러를 위로 당기고 카테터가 제 위치에 유지되도록 어금니에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 와셔를 고정합니다.
      주의 :이 단계를 용이하게 사다리꼴 형상으로 절단 및 와셔 뺨 대향 평탄면 어금니에 대해 그것을 고정.
   8. 다른 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 세탁기를 타고 플라스틱 튜브 아래, 노출 된 바늘에 그것을 밀어하고, 절개에 접촉.
   9. 세탁기가 미끄러지지 않도록 삼각형 "플래그"를 만들기 위해 멸균 테이프를 사용, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 와셔를 고정합니다. 세척 보안쥐의 피부와 멸균 테이프에 대한 어.
   10. 튜빙 2-4 센티미터 쥐의 머리 위에 노출 될 수 있도록 노출 된 카테터를 잘라.
   11. 반복 입의 반대쪽 2.2.10를 통해 2.2.1 단계를 반복합니다.
3. 전압 전류에 대한 두개 내 수술
   1. (3주기를 반복하여 수행, 70 % 에탄올 스크럽 다음 betadine 스크럽) 정위 프레임에서 쥐를 놓고 2 단계 스크럽을 사용하여 동물의 두피를 청소합니다.
   2. 두피 조직의 15 X 15mm 부분을 절단하기 위해 멸균 바늘 코 핀셋 및 수술 가위를 사용합니다.
   3. 부드럽게 멸균 면화 팁 어플리케이터를 이용하여 두개골의 표면을 청소. 또한 3 % 과산화수소 2 ~ 3 방울을인가함으로써 두개골을 청소.
   4. 참조 차기 나사의 후속 삽입을위한 두개골에 3 작은 (1 mm 직경) 구멍, 가이드 캐뉼라 1 구멍, 자극 전극 1 홀 1 홀을 만들기 위해 정위 드릴을 사용하여탔다.
   5. NAC의 핵심에서 녹음을 위해, 1.2 mm 전방에서 가이드 캐뉼라를 놓고 1.4 mm의 브레 그마 측 방향. 플라스틱베이스는 두개골과 같은 높이가 될 때까지 정맥 장치를 낮 춥니 다.
   6. 가이드 정맥에 반구의 반대편에 멸균 기준 전극을 배치합니다. 기준을 경질 아래 약 2mm를 낮 춥니 다.
   7. 5.2 mm의 후방과 브레 그마 1.0 mm의 측면에 자극 전극을 놓고 복부 피개 영역 (VTA)을 대상으로 경질 아래에 8.0 mm를 하향 조정했다.
   8. 두개골에 나사를 확보하기 위해 멸균 작은 수술 드라이버를 사용합니다. 이어서, 전극을 자극, 기준 전극을 삽입하고, 캐 뉼러 가이드. 마지막으로, cranioplastic 시멘트를 사용하여 모든 구성 요소를 고정합니다.
   9. 수술 후의 치료의 첫 48 시간, 피하 주사 (5 ㎎ / ㎏)에 의해 비 - 스테로이드 계 소염 약물 (NSAID) 카프로 펜을 투여. 이전 voltam을 수행하는 완전한 수술 복구를 위해 적어도 일주 허용metry 기록.
      1. 수술 후 치료하는 동안, 매일 물로 구강 카테터. 씹는 먹는에 동물을 돕기 위해 2 일 동안 물에 포화 음식을 제공합니다. (때문에 가벼운 감염이나 탈수에) 고통의 스트레스의 잠재적 징후를 매일 모니터링을 제공하고 필요에 따라 적절한 개입을 제공 (유체의 관리, 방부제의 국소 투여를 포함하고, 또는 NSAID 카프로 펜 관리 5 ㎎ / ㎏에서).

3) 깨어있는 순환 전류 전압 곡선 녹음, 자유롭게 이동 쥐

1. 전극을 낮추고 DA 훈련 세트를 획득.
   1. 실험의 날, 물 200 μl를 주입하고 구강 안면 반응을 관찰하여 구강 정맥의 개통을 확인 (쥐가 물 시음되어 있는지 확인합니다).
   2. 바이폴라 자극 전극 cannu로 (headstage)에 자극 전극을 삽입하여 쥐에 FSCV의 headstage 첨부라 (쥐). 따라서 headstage (전류 전압 변환기를 소형화)는 양극성 자극 전극에 직접 접속한다.
   3. 캐 뉼러 장치로부터 더미 캐뉼라를 제거하고 캐 뉼러로 50 % 헤파린 용액 2 방울을 적용한다. 부드럽게 이후 실험 기간 동안 삽입됩니다 탄소 섬유 전극을 깰 것이다 발생할 수있는 혈전이나 아교 흉터, 취소 (이전에 제거 된 더미 정맥가 약간 이상) 더미 캐뉼라를 삽입합니다. (적어도 2mm 기록 사이트 위) 두개골 아래에 혈전에게 3-4mm를 삭제에 사용되는 정맥을 확장합니다.
   4. 가이드 정맥으로, 전극, 미세 조작기를 삽입하고 "잠금"위치에 오메가 링을 배치합니다.
   5. 해당 핀에 headstage에서 기준 전극 와이어를 연결합니다. 그런 다음 headstage에 해당 와이어 미세 조작기에서 작동 전극 와이어를 연결합니다.
   6. ELEC를 내립니다두개골 아래 약 4-4.5 mm의 trode.
   7. 삼각 파형 (400 V / S, -0.4로 1.3 V)를 적용 할 텐쇼를 사용합니다. 후속 실험 기록을 위해 10 Hz로 파형인가 빈도를 변경, 적어도 10 분 동안 60 Hz에서 전극의 파형을 적용한다.
      참고 : 60 Hz의 파형 도포 공정이 안정된 탄소 섬유 표면을 생성 및 전기 드리프트를 방지 할
   8. DA 방출하여 pH 상이한 농도를 연상, 모든 2 MS / 위상의 펄스 폭 VTA 다양한 주파수 펄스 (10 내지 30 펄스)과 전류 (50 내지 150 μA) (10에서 60 Hz)를 사용하여 전기 자극을 가하기 변화. DA 릴리스의 적어도 5 가지 농도와 5 가지의 pH 변화를 취득. 소포 재로드 [14] 수 있도록 자극 사이 - (3 분 최소 2)를 기다립니다.
      참고 : 다음 중 수집됩니다 전체 범위에 걸쳐 DA 농도를 생산 자극을 얻기 위해 중요하다그들이 주요 구성 요소 분석 (5.1 절 참조) 훈련 세트로 사용되기 때문에 실험.
   9. NAC 코어 (DURA 6.3 밀리미터 복부)에 전극을 낮 춥니 다. 과도 DA 놓기 이벤트는 분 당 적어도 하나의 주파수에서 관찰 될 때까지 계속해서 NAC 코어 내에서 100 ㎛ 단위로 전극을 낮 춥니 다.
   10. 주사기 펌프에 부착 된 20 mL의 주사기에 튜브 (내경이 1/32 "외경 3/32")을 연결한다. 상기 튜브의 다른 쪽 끝에, 쥐의 정맥에 튜브를 연결하는 경 사진 23 G 바늘을 사용한다. 튜브가 원하는 tastant 완전히 충전되어 있는지 확인하고, 거품이 튜브에 없는지 확인합니다.
       주 : 일반적으로, 이전에 기록 주입 제는 전체 투여 량 아니라 튜브의 잔류 물 또는 공기를 전달하도록 레코딩을 쥐의 입으로 tastant 소량을 관리. 또한,이 몇 가지 사전 경험 재치을 가지고 동물을 허용한다H 소설 tastants 이후 tastant, 심지어 appetitive 사람은, 인해 참신에 처음 혐오가 될 수 있습니다.
   11. 데이터 수집, tastant 200 μL (6.5 펌프를 사용하여 초 이전에 설명 튜브)를 달이다. tastant마다 1-3 분 달이다. tastant 당 25 배의 총 달이다. 각 주입 용액 200 μl를 제공합니다.
   12. 여러 tastants은 하나의 실험에 전달되는 경우, 하나 tastant에 대한 데이터를 수집 한 후 물과 함께 경구 용 카테터를 세척하고 새 tastant를 주입하기 전에 적어도 20 분을 기다립니다.
   13. DA 기록 세션 후에, 상기 기록 위치에 작은 병소를 생성하여 조직 학적 확인을 위해 준비한다. 후속 캘리브레이션에 대한 탄소 섬유의 전극을 보존하기 위해, 먼저 전극을 후퇴 미세 조작기를 제거한다. 원래 탄소 F로 (경막 아래) 같은 깊이에 유리 미세과 (유리 팁을 넘어 100 μm의 연장) 텅스텐 와이어 새로운 미세 조작기를 사용IBER 미세.
   14. 10 V의 설정에 도달 할 때까지 조직 학적 확인을 위해, 상기 텅스텐 와이어에 3 V를인가하고, 1 단위 V의 전압을 증가시켜 매 10 초를 작은 병변을 생성한다.
   15. 표준 농도 곡선 이미 복수의 카본 파이버 전극을 이용하여 생성 된 경우, 직접 전위 탄소 섬유 전극을 적용하여 (3.1.14) 위 병변 단계를 수행한다.
       주 :이 병변 방법은 탄소 섬유를 손상하고 특정 전극과 후속 캘리브레이션을 방지한다.
   16. 치명적인 주입 펜토 바르 비탈 (150 ㎎ / ㎏, IP)을 사용하여 동물을 안락사.
   17. headcap에 직접 위로 당겨 플라이어를 사용하여 캐 뉼러와 headcap을 제거. 이 뇌에 불필요한 손상을 줄 수 있으며 그 도전 조직학 중에 전극의 위치를​​ 식별 할 것이기 때문에 headcap 비틀 지 않는다.
       1. 30 % SU 다음 3 일간 4 % 포르말린에 뇌와 장소를 제거1 주간 crose. , 저온 유지 장치를 사용하여 30 μm의 조각 만들기 탄소 섬유 또는 텅스텐 병변의 위치를​​ 식별하기 위해 광학 현미경 슬라이스를 커버 전표에 탑재하고 검사합니다.
          참고 : 관류가 3.1.17에 대한 선택 사항입니다.

4) 전극 보정

1. 전류 - 농도 변환 계수를 생성하는 플로우 셀을 사용.
   1. 전극의 감도를 결정하기 위해, 유동 "T- 세포"장치를 사용하여 각 실험 후에 전극을 교정. 트리스 완충액, pH가 솔루션 또는 솔루션은 DA (2 ml / 분의 속도로)의 전극 표면에 걸쳐 세정 중에 "t 셀"에 전극을 내린다. 버퍼의 pH 또는 DA 솔루션 사이에 앞뒤로 전환 할 여섯 위치 공기 솔레노이드 액추에이터를 사용합니다.
   2. 각 교정, 20 초,이어서 pH와 DA 용액 5 초 애플리케이션 이어 트리스 완충액 (기준선)의 5 초인가에 순환 전류 전압 곡선 데이터를 수집트리스 버퍼 (30 초 총 파일)의 pplication. 각 표준의 서로 다른 농도 사이의 상쇄, 각 교정 표준 농도에 대한 각각의 실행을 3 번 반복합니다.
   3. 각 샘플 수집, 피크 DA 또는 pH의 유발 전류를 측정한다. 피크 전류의 관계에 비해 농도를 얻기 위해 각각의 시험에 걸쳐 피크 전류를 평균. 더 자세한 설명은 [12]과 [13]를 참조하십시오.

5) 데이터 분석

1. 주성분 분석에 설정된 트레이닝 사용 (PCA)
   주 : 전압 전류 실험 기간 동안, 출력은 도파민 산화 및 환원, 산도 변화 및 ​​전기 잡음의 결과 인 현재로서 생성된다. 하나의 바람직한 성분 (DA하여 pH)을 분리하고, 원하는 신호를 왜곡시킬 수있는 추가 성분 제거 할 수 있도록 PCA는 (보다 상세한 설명을 ^{위해, 15, 16} 참조)이 요인을 분리 할 수있다.
   1. 토륨 교정 계수를 할당즉 출력 전류 PCA 후 (약 50-10 nA의 / μM)는 분석 물의 농도 값이 결정될 수 있도록한다.
   2. "기차"PCA 모델 (DA), 산도 및 기타 요인을 분리하는 실험 기간 동안 얻은 학습 집합을 사용합니다. PCA는 순환 전압 전류를 설정 교육 (섹션 3.1.8에서 수집)을 받아 볼타 모 그램의 본질적인 특성이 생체 내 전압 전류 녹음 동안 수집 된 각각의 분석을 식별하는 데 사용할 수있는 사용자를 결정합니다.
   3. 유지하는 주 성분들의 수를 결정하는, 말리노프스키 F 테스트를 사용한다. 일반적으로, 일반적으로 데이터를 분산의 약 95~99% 설명 만 2 ~ 3 주 구성 요소를 유지합니다. 말리노프스키 F 테스트를 구현하는 방법에 대한 자세한 설명은 ^17를 참조하십시오.
      주 : 부품 개수가 결정되면, PCA 분석 효과적으로 DA로부터 측정 볼타 모 그램을 투영하며 pH가 훈련이 유지 된 주 성분에 설정한다.결과 (예상 출력 대표 결과 참조) 만 DA (또는 pH가) 데이터가 남아 있고 DA 유사 또는 산도 않는 잔차 데이터가 제거 될 수 있도록 필터링 된 데이터 세트이다. 순환 전류 전압 곡선 분석 (PCA)를 사용하는 단계 명령에 의해 더 자세한 설명과 단계 재료 시트와 ^{16, 17을} 참조하십시오.

결과

구강 내 카테터 삽입술과 결합 FSCV 방법 크로스, appetitive tastant을 검사하는 데 사용되었다 NAC 코어에 phasic DA 자료를 변조한다. tastant 주입, 전기 자극하기 전에.; VTA의 (150 μA, 60 Hz에서, 24 펄스 빨간색 막대로 표시)은 그림 1 NAC (그림 1)에서 phasic 다 릴리스의 강력한 증가를 생산 잠재력을 가진 컬러 플롯을 보여줍니다 Z 축의 Y 축, X 축에 시간 및 전류 (거짓 색으로 표시). 색상 플롯 아래 시간 추적 대 DA 농도이다. 시간에 대한 농도는 도파민의 산화 전위에서 전류 대 시간 추적을 사용하여 측정 하였다 전극의 교정 후 다음과 같은 농도로 전환시켰다 (점선 흰색 선으로 표시). 시간 추적이 DA 대 농도는 PCA에 설정된 훈련의 일부로서 사용되었다.

자당의 훈련 세트를 획득 한 후, 25 주입(10 %, 주입 당 200 μL)을 매 ...

토론

FSCV과 함께 구강 tastant 배달 구강 향미를 "실시간"다 응답의 분석을 허용한다. 성공적인 DA 측정에 필요한 프로토콜의 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 구강 카테터의 적절한 주입은 향미의 전달을 위해 중요하다. 카테터는 제 1 대구치 뒤에 삽입하고 제자리에 쐐기되는 것을 보장하는 것은 개통을 잃지 카테터를 방지하고 동물에 의해 실수로 삭제되는 것을 방지 할 수 있습니다. 복구 후 처음 며칠 동안 카테터를 플러싱하는 제 2 또는 3 일 동안 동물에게 주어진 소프트 음식 수술 후는 카테터를 방해 할 수 있기 때문에, 또한 중요하다. 둘째, 전극의 품질이 자유롭게 움직이는 랫트에서 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 중요하다. 어떤 경우에는, 시각적으로 표시 전극은 높은 품질과 여전히 잡음 신호를 제공 할 수 있습니다 좋은 조건이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 D에서 기준 기록을하는 것입니다orsal의 선조체 (DURA 아래 4mm). 전극 너무 많은 소음이 발생하는 경우,...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자극 전극	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	주문 시 전극용 받침대 아래 22mm 절단
뉼라	BioAnalytical Systems	MD-2251
유리 모세관	A-M 시스템
탄소 섬유	Thornel	T650
전극 풀러	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
열 수축	3M	FP-301
전극용 절연 전선	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. at Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
에폭시	ITW Devcon	14250	"5 분 에폭시 "
퍼 플루오로 -3,6- 디옥사 -4- 메틸 -7octene- 술폰산과 테트라 플루오로 에틸렌	이온 파워	LQ-1105	i.e., < / em> 나피온
실버 페인트	GC Electronics	22-023
전원 공급 장치	BK Precision	9110
튜빙 구강 내 카테터	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
구강 내 주입용 튜브	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
플로우 셀용 주사기 펌프	Pump Systems Inc.	NE 1000
외과용 시멘트	Dentsply 코크	675571 및 675572
에어 액추에이터	VICI	A60	6 위치 디지털 밸브 인터페이스
디지털 밸브 인터페이스	VICI	DVI	230 VAC
쿼드 헤드 스테이지	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI 전원 공급 장치	Univ. of N. Carolina, Electronics 시설
UEI 브레이크아웃 박스	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
tastant 주사기 펌프용 전원 공급 장치	Med Associates	SG-504
Tastant 주사기 펌프	Med Associates	PHM-107
텅스텐 미세 전극	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver 와이어 레퍼런스(AgCl	InVivo 포함) 미터법	E255A
수당	시그마	80497
염화마그네슘	시그마	M8266
클로이드 나트륨	시그마	S7653
과염소산	시그마	244252
염산(4M)	시그마	54435
수산화	시그마	306576
과산화수소	Sigma	H1009
도파민 염산염	Sigma	H8502
TarHeel HDCV 소프트웨어	노스 캐롤라이나 대학교 채플 힐		소프트웨어를 요청해야 합니다: 소프트웨어 요청 페이지에 대한 링크를 보려면 여기를 클릭하십시오