Method Article

깨어 쥐의 구강 내 Tastant 관리하는 동안 빠른 스캔 순환 전압 전류 법으로 빠른 도파민 역학 시험

DOI:

10.3791/52468

⸱

August 12th, 2015

 ,  ,  , 
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

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Summary

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세포외 도파민(DA)의 급격한 변동은 포유류의 보상 처리와 동기 부여 행동을 모두 중재합니다. 이 원고는 깨어 있고 자유롭게 움직이는 쥐에서 타스탄트가 빠른 도파민 방출을 어떻게 변경하는지 결정하기 위해 FSCV(Fast Scan Cyclic Volammetry)와 구강 내 타스탄트 투여의 조합을 설명합니다.

Abstract

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포유류의 뇌에서 빠르게, 위상 도파민(DA) 방출은 보상 처리, 강화 학습 및 동기 부여 제어에 중요한 역할을 합니다. FSCV(Fast Scan Cyclic voltammetry)는 여러 유형의 제제에서 위상 DA 방출을 검사하는 데 사용되는 높은 공간 및 시간(초 미만) 해상도를 가진 전기화학 기술입니다. 단세포 및 뇌 절편에 대한 시험관 내 실험과 마취된 설치류에 대한 생체 내 실험은 정상적인 조건과 질병 모델에서 도파민 방출 및 흡수를 매개하는 메커니즘을 확인하는 데 사용되었습니다. 지난 20년 동안 깨어 있고 자유롭게 움직이는 설치류를 대상으로 한 생체 내 FSCV 실험은 보상 처리 및 보상 학습에서 도파민 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다. 깨어 있고 자유롭게 움직이는 준비의 주요 장점 중 하나는 특정 행동 이벤트나 보상 또는 신호 프레젠테이션에 시간이 고정된 빠른 DA 변동을 조사할 수 있는 능력입니다. 그러나 행동과 전압전류법 실험을 결합한 것의 한 가지 한계는 1차 보상 또는 혐오적 자극에 특이적인 DA 효과를 보상 지향적 또는 기타 운동 행동을 매개하는 동시에 발생하는 DA 변동과 분리하기 어렵다는 것입니다. 여기에서는 깨어 있는 쥐에서 생체 내 FSCV와 구강 내 주입을 사용하여 구강 타구에 대한 DA 반응을 직접 조사하는 결합 방법을 설명합니다. 이 실험에서는 구강 타스탄트를 쥐의 입맛에 직접 주입하여 보상 지향적 행동과 자발적인 음주 행동을 우회하여 타스탄트 자극에 대한 DA 반응을 직접 조사할 수 있습니다.

Introduction

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Phasic DA release는 보상 지향 행동을 중재하는 데 중요한 역할을 합니다[1-3]. 그러나 1차 보상이 위상적 DA 방출을 어떻게 변화시키는지 분리하고 연구하는 것은 종종 위상적 DA 방출을 변경할 수 있는 동시 발생 행동 또는 인지 프로세스(예: 보상을 획득하기 위한 의사 결정 과정 또는 보상 지향 운동 행동)로 인해 복잡합니다. 현재 연구에서는 구강 내 캐뉼러를 통한 타스탄트 전달과 결합된 생체 내 고속 스캔 순환 전압전류법(FSCV)을 사용하여 타스탄트에 대한 위상 DA 반응을 분리합니다. 이 기술은 선택과 행동을 우회하고 쥐의 입천장에 타스탄트를 직접 주입하는 동안 세포 외 DA 방출을 검사할 수 있습니다.

FSCV는 시간 및 공간 분해능이 높은 전기화학 기술로, 초 미만의 스케일(10Hz 분해능)로 개별 국소 영역(약 100μm)에서 DA 방출을 측정할 수 있습니다. 구강 내 전달과 FSCV의 조합은 기존의 미세 투석 방법으로는 검사할 수 없는 타탄트에 대한 빠른 '실시간' DA 반응을 관찰할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한, 보상 또는 보상 관련 신호에 대한 응답으로 위상 DA 방출은 20-100nM 사이의 농도에서 발생하며, 이는 FSCV에 대한 10-20nM 검출 임계값보다 높습....

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Protocol

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모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 (NIH) 가이드의 국립 연구소에 따라 수행하고, 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1) 수술 전 준비

  1. 구강 솔루션 준비
    1. 10 % 자당과 탈 이온수에 0.005 %의 L - 멘톨 (PH 7.4)의 솔루션을 만듭니다. 실온에서, 밀폐 용기에이 솔루션을 저장하고 저하를 방지하기 위해 2 주마다 리메이크.
  2. 전극 보정 ​​용액
    1. 교정하기 전 언제든지 트리스 완충액 (pH 7.4)을 확인. 이 솔루션은 12.0 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 3.25 mM의 KCl을, 1.20 mM의 CaCl2를, 1.25 mM의 NaH2PO4, 1.20 mM의의 MgCl 2, 2.00 mM의 나 2 SO 4로 구성되어 있습니다.
    2. 0.1 M 과염소산에서 10 mM의 도파민 (도파민 염산염 DA)의 원액을 만듭니다. 과염소산은 dopamin의 산화를 방지하는 데 도움이전자. -20 ° C에서이 원액을 저장하고 최대 6 개월 동안 사용합니다. 한 번만 각 나누어지는을 사용하려면 저장을 위해 다 원액의....

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Results

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구강 내 카테터 삽입술과 결합 FSCV 방법 크로스, appetitive tastant을 검사하는 데 사용되었다 NAC 코어에 phasic DA 자료를 변조한다. tastant 주입, 전기 자극하기 전에.; VTA의 (150 μA, 60 Hz에서, 24 펄스 빨간색 막대로 표시)은 그림 1 NAC (그림 1)에서 phasic 다 릴리스의 강력한 증가를 생산 잠재력을 가진 컬러 플롯을 보여줍니다 Z 축의 Y 축, X 축에 시간 및 전류 (거짓 색으로 표시). 색상 플롯 아래 시간 추적 대 DA 농도이다. 시간에 대한 농도는 도파민의 산화 전위에서 전류 대 시간 추적을 사용하여 측정 하였다 전극의 교정 후 다음과 같은 농도로 전환시켰다 (점선 흰색 선으로 표시). 시간 추적이 DA 대 농도는 PCA에 설정된 훈련의 일부로서 사용되었다.

자당의 훈련 세트를 획득 한 후, 25 주입(10 %, 주입 당 200 μL)을 매 .......

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Discussion

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FSCV과 함께 구강 tastant 배달 구강 향미를 "실시간"다 응답의 분석을 허용한다. 성공적인 DA 측정에 필요한 프로토콜의 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 구강 카테터의 적절한 주입은 향미의 전달을 위해 중요하다. 카테터는 제 1 대구치 뒤에 삽입하고 제자리에 쐐기되는 것을 보장하는 것은 개통을 잃지 카테터를 방지하고 동물에 의해 실수로 삭제되는 것을 방지 할 수 있습니다. 복구 후 처음 며칠 동안 카테터를 플러싱하는 제 2 또는 3 일 동안 동물에게 주어진 소프트 음식 수술 후는 카테터를 방해 할 수 있기 때문에, 또한 중요하다. 둘째, 전극의 품질이 자유롭게 움직이는 랫트에서 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 중요하다. 어떤 경우에는, 시각적으로 표시 전극은 높은 품질과 여전히 잡음 신호를 제공 할 수 있습니다 좋은 조건이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 D에서 기준 기록을하는 것입니다orsal의 선조체 (DURA 아래 4mm). 전극 너무 많은 소음이 발생하는 경우,.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 간행물에 보고된 연구는 NSF 대학원 연구 펠로우십(RJW)과 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 및 FDA 담배 제품 센터(CTP)의 약물 남용 연구소(P50DA036151 National Institute on Drug Abuse)의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
자극 전극PlasticsOneMS303/2-A/SPC주문 시 전극용 받침대 아래 22mm 절단
뉼라BioAnalytical SystemsMD-2251
유리 모세관A-M 시스템
탄소 섬유ThornelT650
전극 풀러Narishige InternationalPE-22
Neurolog stimulus isolatorfigure-materials-1 Digitimer Ltd.DS4
열 수축3MFP-301
전극용 절연 전선Squires electronicsCustomL 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
MicromanipulatorUniv. at Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
에폭시ITW Devcon14250"5 분 에폭시 "
퍼 플루오로 -3,6- 디옥사 -4- 메틸 -7octene- 술폰산과 테트라 플루오로 에틸렌이온 파워LQ-1105i.e., < / em> 나피온
실버 페인트GC Electronics22-023
전원 공급 장치BK Precision9110
튜빙 구강 내 카테터Intramedic427426PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
구강 내 주입용 튜브Fischer Scientific02-587-1AI.D. 1/32"; O.D. 3/32"
플로우 셀용 주사기 펌프Pump Systems Inc.NE 1000
외과용 시멘트Dentsply 코크675571 및 675572
에어 액추에이터VICIA606 위치 디지털 밸브 인터페이스
디지털 밸브 인터페이스VICIDVI230 VAC
쿼드 헤드 스테이지Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI 전원 공급 장치Univ. of N. Carolina, Electronics 시설
UEI 브레이크아웃 박스Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
tastant 주사기 펌프용 전원 공급 장치Med AssociatesSG-504
Tastant 주사기 펌프Med AssociatesPHM-107
텅스텐 미세 전극MicroProbesWE30030.5A3
Silver 와이어 레퍼런스(AgClInVivo 포함) 미터법E255A
수당시그마80497
염화마그네슘시그마M8266
클로이드 나트륨시그마S7653
과염소산시그마244252
염산(4M)시그마54435
수산화시그마306576
과산화수소SigmaH1009
도파민 염산염SigmaH8502
TarHeel HDCV 소프트웨어노스 캐롤라이나 대학교 채플 힐소프트웨어를 요청해야 합니다: 소프트웨어 요청 페이지에 대한 링크를 보려면 여기를 클릭하십시오
캐 요청 624503 의 공중 합체 나트륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
  2. Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-....

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Fast Scan Cyclic VoltammetryDopamine DynamicsIntra oral Tastant AdministrationAwake RatsNucleus AccumbensCarbon Fiber ElectrodesOral Catheter ImplantationPrinciple Component AnalysisSub second Dopamine ReleaseReward Processing

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