방법 논문

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

DOI:

10.3791/52482

⸱

2015년 5월 3일

 ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

이 논문에서

요약

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이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

초록

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이러한 인산화, 메틸화, 아세틸 화, 유비퀴틴 및 sumoylation 같은 번역 후 변형 (PTMS)는, 많은 단백질의 세포 기능을 조절한다. 센트로 DNA와 연관 동원체 단백질의 PTMS는 유전체의 안정성을 유지하기 위해 충실한 염색체 분리를 중재. 같은 질량 분석 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 생화학 적 접근 방법이 가장 일반적으로 PTMS의 식별을 위해 사용된다. 여기서, 단백질의 정제 방법은, 사카로 마이 세스 세레 비지에 동원체 단백질 Ndc10 및 Ndc80의 sumoylation 및 유비퀴틴 양쪽의 검출을 허용하는 기술된다. Ndc10 Myc와 - 태그 또는 Ndc80가 건설하고 우리의 연구에 사용 된 표현 폴리 히스티딘 플래그 태그가 Smt3 (HF-Smt3) 및 변형. sumoylation의 검출을 위해, 우리는 니켈 비드를 사용하여 자신 태깅 sumoylated 단백질을 정제 친화력 프로토콜을 고안 sumoylated Ndc10 A를 검출하기 위해 항 - 나 Myc 항체로 웨스턴 블롯 분석을 이용ND Ndc80. 유비퀴틴의 검출을 위해, 우리는 Myc와 태그가 단백질의 면역을위한 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80이가 도처 것을 보여 방지 UB 항체와 웨스턴 블롯 분석을 사용했다. 우리의 결과는 그의 플래그에 대한 관심의 에피토프 태그 단백질이 Smt3 변형 여러 PTMS의 검출을 용이하게 태그를 보여줍니다. 앞으로의 연구는이 기술의 개발은 특정 PTM에 의존 단백질 상호 작용을 식별하고 특성화 할 수 있도록해야한다.

서론

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각각 표적 단백질에 (S. cerevisiae의 1 Smt3 SUMO) 유비퀴틴과 sumoylation는 유비퀴틴과 작은 유비퀴틴 같은 수정의 활용을 할 수 있습니다. 동원체 단백질 PTMS 충실한 염색체 분리를 보장하기 위해 상이한 세포주기 단계에서 자신의 세포 수준 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미친다. 예를 들어, Cse4 / CENP-A 및 외부 동원체 단백질 Dsn1의 세포 수준 게놈 안정성 2-5을 보장하기위한 유비퀴틴 매개 단백질 분해에 의해 조절된다. 잘못된 동원체 - 미세 소관 첨부 불안정 직접 미세 소관 6-8과 상호 작용 Dam1과 Ndc80 단지를 인산화 Ipl1 / 오로라 B 키나제가 필요합니다. 일흔을 통해 동원체 단백질의 확인에도 불구하고, PTMS, 예를 들어, 유비퀴틴과 SUMO 이러한 단백질의 변형을 조사 거의 연구가있다. 주요한 제한은 PTM을 보존하는 능력이다정화 및 sumoylation, 인산화, 메틸화, 등과 같은 PTMS의 검출을위한 사용자 정의 항체의 소수 중의. sumoylated 동원체 단백질의 특성은 Ndc10, Cep3는 Bir1 및 Ndc80 사용자 정의 항체 (9)를 이용했다. 또한 Ndc10 유비퀴틴은 10 기재로서 연루되어왔다. 인간 Hec1 (S. cerevisiae의에서 Ndc80)도 APC / C-hCdh1 E3 리가 아제 (11)에 의해 규제, 유비퀴틴 화를 위해 기판이다. 따라서, Ndc10 및 Ndc80는 S.에서 sumoylation 및 유비퀴틴을 모두 감지 할 수있는 프로토콜의 최적화를위한 좋은 후보입니다 cerevisiae의.

sumoylation의 식별을 용이하게하기 위해, 우리는 HF-Smt3 및 Myc와 태그가 Ndc10 또는 Ndc80을 표현 균주를 건설했다. 에피토프 태그 (HF :을 His6-FLAG)의 사용으로 인해 자주 후보 단백질에 대해 발생하는 폴리 클로 날 혈청에서 관찰되고 교차 반응의 배경을 최소화한다. 우리는 선호도와 프로토콜을 고안HF-Smt3 접합체를 정제 한 다음 정제 Smt3 제제 sumolyated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검출하기 위해 상업적 방지 플래그 및 안티 나 Myc 항체를 사용 하였다. 유비퀴틴을 위해, 우리는 Myc와 태그가 동원체 단백질의 유비퀴틴 화를 보존하는 변형 된 면역 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지하는 상업 항 UB 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다.

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프로토콜

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효모 세포의 성장 (1)

  1. 작은 플라스크에 YPD (표 1) 30 ㎖에 효모 세포를 접종한다. 진탕 30 ℃에서 밤새 품어.
  2. YPD 50ml에 600 나노 미터 (600 OD = 0.2)에서 0.2의 광학 밀도로 세포를 희석하고, 진탕하면서 30 ℃에서 배양한다.
  3. 600 nm의 (OD 600 = 1.0)에서 1.0의 광학 밀도 문화를 성장.
  4. 원심 분리기 세포 2,000 XG에 5 분 동안 상층 액을 버린다.
  5. 세포를 세척 2000 XG에서 5 분 동안 40 ml의 멸균 원심에서 세포 펠렛을 재현 탁. 뜨는을 취소하고 -20 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다.

단백질 2. 추출

  1. 또는 니켈의 superflow NTA 비드를 사용 풀다운 분석 용 빙냉 구아니딘 완충액 (표 1) 0.5 ㎖ 중의 재현 탁 세포 면역에 대한 A (표 1) 버퍼. 항상 얼음에 튜브를 유지합니다.
  2. 2m로 이동L 스크류 캡 튜브.
  3. 유리 구슬의 동일한 볼륨 (자료 표)를 추가합니다.
  4. 다음 2 ~ 3 분 동안 얼음에 배치, 실온에서 2 분 동안 미니 비드 비터의 셀 (자료 표)를 구슬은-이겼다. 이 세 번 반복합니다.
  5. 30 ~ 60 분 동안 4 ℃에서 고속에 소용돌이. 세포가 용해되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 시각화하여 세포를 확인합니다.
    참고 : 용균 세포는 어두운 유령을 표시하고 경계 또는 정의 된 모양이 부족합니다. 최적의 셀의 적어도 80 %를 용해한다.
  6. 15ml의 원뿔형 튜브 (스크류 캡이 느슨 함) 컬렉션에 푸시 핀과 장소를 이용하여 튜브의 바닥에 구멍을 천공.
  7. 해물를 수집하기 위해 1 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
  8. 마이크로 원심 분리기 튜브에 해물을 전송합니다.
  9. 4 ℃에서 30 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기는 추출 된 단백질을 수집합니다.
  10. ASSA 단백질을 사용하여 추출 된 단백질의 농도를 측정Y 키트 (자재 표)과 모든 추출물을 정상화는 동일한 양의 단백질을 함유한다. 적절한 버퍼 1 ml의에 총 볼륨을 가져 오십시오.
    참고 : 총 단백질의 약 5 mg의 50 OD 600 세포로부터 얻어진다.
  11. 전체 세포 추출물 (WCE)와 같은 (2.10 단계에서 추출 된 총 단백질은 5 mg의 경우 250 μg의 단백질) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 (표 1) 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 로드 웨스턴 블롯 분석 (5 절 : 웨스턴 블롯 분석)에 대한 SDS-PAGE 젤의 각 샘플의 10 μL.

HF-Smt3 복합체 3. 정제

  1. 실험 1 분간 저속 원심 분리 (800-1,500 XG)에 의해 (샘플 당 구슬 100 ㎕)에 필요한 니켈 NTA의 superflow 비즈 (재료 표)를 얻습니다. 상층 액을 제거합니다.
  2. 워시 비즈 PBS (자료 표)의 1 ml의 5 배 : 반전 최고의 오버구슬이 재현 탁 될 때까지 바닥, 저속 원심 분리하여 구슬을 수집하고 뜨는을 제거합니다.
  3. 구아니딘 완충액 (표 1) 1 ㎖에 비드를 일시 및 처리 대상에 대응하는 샘플 튜브의 개수로 나누어지는. 저속 원심 분리하여 구슬을 수집하고 뜨는을 제거합니다. 상단을 통해 반전 바닥에서 잘 구슬을 섞는다.
    참고 : 상단 오버 바닥을 반전 잘 구슬을 섞는다.
  4. 니켈 NTA의 superflow 구슬 100 μL에 각 샘플의 경우, (단백질의 추출 단계 2.11에서) 나머지 WCE의 950 μl를 추가합니다.
  5. 적어도 4 시간 또는 밤새 4 ℃에서 흔들 플랫폼에 품어.
  6. 4 ℃에서 1 분 800-1,500 XG에 원심 분리기.
  7. 상층 액 (삭제) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 로드 웨스턴 블롯 분석 (제 5 SDS-PAGE 젤의 각 샘플의 10 μL : 웨스턴 블롯 항문이 Analysis).
  8. 락을 플랫폼에 한 번 5 ~ 10 분 동안 구아니딘 버퍼 1 ml의 씻을 구슬.
  9. 워시 비즈 락 플랫폼에서 5 ~ 10 분 동안 버퍼 (표 1)을 깨고 1 ml의 5 배.
  10. 배 램 믈리 샘플 버퍼의 90 μL에 재현 탁 구슬.
  11. 1 M 이미 다졸의 10 μl를 추가합니다.
    참고 : 이미 다졸 인해 이미 다졸과 구슬 사이의 경쟁의 상호 작용에 니켈 NTA 비즈에서 그의 태그가 단백질을 해리하는 데 도움이됩니다.
  12. 3-5 분간 가열 블록에서 100 ° C에서 인큐베이션.
  13. 소용돌이, 다음 30 초 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  14. (: 웨스턴 블롯 분석 제 5 절) 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤에서 각 샘플의 부하 10 ~ 20 μL.
    주 : WCE 5mg을 사용하는 경우는 10 ~ 20 μL, 0.5-1.0 mg의 입력에 대응한다.

Myc와 태그가 동원체 단백질 4. 면역 침전

  1. 반 C-Myc와 아가 로스 친 화성 젤을 구하는tibody (자료 표) 저속 원심 분리 (800-1,500 XG)에 의한 실험 (샘플 당 수지 25 μL)에 필요한. 상층 액을 제거합니다.
  2. 버퍼 1 ml의 씻을 수지 5 배 : 수지가 재현 탁 될 때까지 반전 최고의 오버 바닥, 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다.
  3. 완충액 1 ㎖에서 수지를 일시 및 처리 대상에 대응하는 샘플 튜브의 개수로 나누어지는. 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다.
    참고 : 위 이상 바닥을 반전 아니라 수지를 섞는다.
  4. 수지의 25 μL에 : (단백질의 추출 단계 2.11에서) 나머지 WCE의 950 μl를 추가합니다.
  5. 4 ° C에서 하룻밤 흔들 플랫폼에 품어.
  6. 4 ℃에서 1 분 800-1,500 XG에 원심 분리기.
  7. 상층 액 (삭제) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 소호광고 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤 (5 절 : 웨스턴 블롯 분석)에서 각 샘플의 10 μL.
  8. 버퍼 1 ml의 씻을 수지 5 배 : 수지가 재현 탁 될 때까지 반전 최고의 오버 바닥, 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다.
  9. SUMEB 샘플 완충액 (표 1) 100 ㎕에 재현 탁 수지.
    참고 : SUMEB 샘플 버퍼가 8 M 우레아 1 % SDS (강한 변성 조건)가 포함되어 있습니다.
  10. 3-5 분간 가열 블록에서 100 ° C에서 인큐베이션.
  11. 소용돌이, 다음 30 초 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  12. (: 웨스턴 블롯 분석 제 5 절) 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤에서 각 샘플의 부하 10 ~ 20 μL.
    주 : WCE 5mg을 사용하는 경우는 10 ~ 20 μL, 0.5-1.0 mg의 입력에 대응한다.

5. 웨스턴 블롯 분석

  1. 4~12% 비스 - 트리스 젤 (자료 표)와 반환 한의 단백질 추출물을로드ORM 전기는 90 분 동안 120 V에서 (버퍼를 실행 : 자료 표).
  2. 90 분 (: 자재 표 전송 버퍼)에 대해 30 V로 전송 장치를 이용하여 니트로 셀룰로오스 막 (자재 표)로 겔로부터 단백질을 옮긴다.
  3. 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 / 1X TBST (표 1)에서 막을 차단.
  4. 5 % 우유 / 1X TBST 밤새 4 ° C가 차 항체 (자료 표)와 멤브레인을 품어. 1,000 (안티 - 플래그 및 안티 UB 항체) 또는 1 : 5,000 (안티 - Myc와 항체) 일차 항체를 들어, 1의 희석을 사용합니다.
  5. 1X TBST 10 분마다 막 배를 씻으십시오.
  6. 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 / 1X TBST에서 이차 항체 (자재 도표)와 함께 막을 인큐베이션. 이차 항체의 5,000 희석 : 1을 사용합니다.
  7. 1X TBST 10 분마다 막 배를 씻으십시오.
  8. ECL 가공용으로 멤브레인을 품어NG 용액 (자료 표) 5 분.
  9. 블루 민감한 X 선 필름 막 (자료 표)를 노출 및 자동 개발자 (자료 표)를 사용하여 개발할 수 있습니다.

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결과

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이전에 설명 된대로 9,12- 동원체 단백질과 Ndc80 Ndc10의 sumoylation을 검출하도록, HF-Myc와 Smt3 및 태깅 동원체 단백질 (또는 Ndc80 Ndc10)와 균주 (표 2)를 구성 하였다. HF-Smt3 접합체 친화력의 Ni-NTA 비드를 사용하여 정제 하였다. HF-Smt3 (그림 1A와 1B, 왼쪽 패널)없이 제어 변형에 결석했다 스모 기판의 sumoylated 형태의 안티 - 플래그 항체 허용 감지와 정제 HF-Smt3의 웨스턴 블롯 분석. 예상대로, 스모 기판의 여러 형태는 HF-Smt3 변형 검출되었다. Ndc80과 Ndc10이 방지 Myc와 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 정제 HF-Smt3 복합체에 존재하는 경우에 우리는 다음 결정. Ndc80 Ndc10 또는보다 높은 분자량이었다 다중 대역 명확 (도 1A 및 1B,...

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토론

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이러한 HA, Myc와, 플래그 및 GST와 같은 에피토프 태그 널리 단백질의 생화학 적 분석을 위해 사용된다. HF-Smt3 및 Ndc10 Ndc80과 같은 나 Myc 태그가 동원체 단백질과 균주의 구성은 이러한 sumoylation 유비퀴틴과 같은 PTMS의 검출을 용이하게한다. HF-Smt3 분석를 풀다운는 sumoylated 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80 (그림 1)의 검출을 할 수 있습니다. 안티 - 플래그 항체를 이용하여 친 화성 정화 프로토콜과 웨스턴 블롯 분석 HF-Smt3 및 표적 단백질 사이의 상호 작용의 특이성을 설정, 수정 된 단백질은 HF-Smt3없이 제어 변형에 검출되지 않았다있다. 단백질 기질에 Myc와 태그의 사용은 HF-Smt3 접합체에 sumoylated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검증한다. 또한, Ndc10과 Ndc80 모두의 sumoylation는 nocodazole 처리 된 세포 (그림 1C 및 1...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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지원과 조언을 해주신 Oliver Kerscher 박사님과 논문에 대한 지원과 의견을 주신 Basrai 실험실의 구성원들에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유리 구슬BioSpec 제품11079105직경 0.5mm
미니 비드비터BioSpec 제품# 6938 세포 교란 자
Ni-NTA superflowQiagen30430100 ml
프로테아제 억제제 칵테일Sigma-AldrichP82151 ml
Anti-C-Myc agarose 친화성 젤 개미 토끼Sigma-AldrichA74701 ml
Monoclonal anti-Flag M2 항체 마우스Sigma-AldrichF18041차 항체, 희석 1:1,000
c-Myc 항체 (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-7891차 항체, 희석 1:5,000
정제 마우스 항체 단클론 9E10CovanceMMS-150P1차 항체, 희석 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) 단클론 항체CovanceMMS-258R1차 항체, 희석 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP 연결 전체 AbGE Healthcare Life SciencesNA934V2차 항체, 희석 1:5,000
ECL 마우스 IgG, HRP 연결 전체 AbGE Healthcare Life SciencesNA931V2차 항체, 희석 1:5,000
DC 단백질 분석Bio-Rad500-0116
니트로셀룰로오스 멤브레인NovexLC20010.45mm 공극 크기
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔NovexNP0321BOX1.0mm, 10웰
NuPAGE MES SDS Running BufferNovexNP000220x
NuPAGE 전송 버퍼NovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico 화학발광 기판Thermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
청색 민감성 X선 필름DbioDBOF30003
자동 현상액KodakM35AX-OMAT
NocodazoleSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck ChemicalsS261925 mg
에서 생산

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
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  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158(2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

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태그

Ndc10 Ndc80Saccharomyces cerevisiae

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