방법 논문

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

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DOI:

10.3791/52485

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2015년 3월 7일

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1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

이 논문에서

요약

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

초록

성숙한 지방세포는 천장 배양이라는 기술을 통해 체외에서 표현형을 섬유아세포와 같은 세포로 역전시키는 것으로 나타났습니다. 성숙한 지방 세포는 또한 기능 및 대사 특성의 저장소 특이적 특성을 위해 신선한 지방 조직에서 분리할 수 있습니다. 여기에서는 콜라겐분해효소 분해를 사용하여 지방 조직에서 성숙한 지방세포를 분리하기 위한 잘 정립된 프로토콜과 천장 배양을 수행하기 위한 후속 단계에 대해 설명합니다. 간단히 말해서, 지방 조직은 조직 기질을 파괴하기 위해 콜라겐 분해 효소를 포함하는 Krebs-Ringer-Henseleit 완충액에서 배양됩니다. 부유 성숙한 지방 세포는 완충액의 상단 표면에 수집됩니다. 성숙한 세포는 배지로 완전히 채워진 T25 플라스크에 도금하고 일주일 동안 거꾸로 배양합니다. 대안적인 6-well plate culture 접근법을 사용하면 역분화를 겪고 있는 지방세포의 특성을 분석할 수 있습니다. 지방세포 형태는 배양의 시간에 따라 급격히 변화합니다. 면역형광은 FABP4 면역형광 염색에 의해 입증된 바와 같이 6웰 플레이트에서 배양된 슬라이드에서 쉽게 수행할 수 있습니다. FABP4 단백질은 성숙한 지방세포에 존재하지만 지방세포의 역분화를 통해 하향 조절됩니다. 성숙한 지방세포 역분화(dipocyte dedifferentiation)는 세포 치료 및 조직 공학의 새로운 길을 제시할 수 있습니다.

서론

성숙한 지방세포의 체외 역분화는 천장 배양1이라는 기술을 통해 이루어집니다. 수용액에 떠다니는 자연적인 경향 때문에, 고립된 성숙한 지방 세포는 배양 배지로 완전히 채워진 거꾸로 된 플라스크의 표면에 부착됩니다. 며칠에 걸쳐 세포는 구형 형태를 변형하여 섬유아세포와 같은 세포가 됩니다. 그 결과 DFAT(dedifferentiated fat) 세포라고 하는 세포는 다분화능2입니다. 특히 인간 세포에 대한 지방 세포 역분화에 대한 연구 논문은 제한적입니다. 그러나 그들은 이미 DFAT 세포2의 다능성, 세포 표현형 및 복제 능력에 관한 흥미로운 정보를 제공했습니다. 인간의 내장 및 피하 지방 조직에서 유래한 지방세포를 포함하여 다양한 지방 구획에서 유래한 성숙한 지방세포는 성공적으로 역분화되었다2-4. 이러한 저장소 외에도 Kishimoto와 공동 연구자들은 협측 지방 패드와 역분화된 지방 세포의 지방 조직을 DFAT 세포로 샘플링했습니다5. Matsumoto와 공동 연구자들은 다양한 연령대의 환자로부터 피하 DFAT 세포를 성공적으로 생성했으며, 대부분의 세포는 배양2에서 10번의 계대 후에도 높은 증식률과 6% 미만의 노화를 보였습니다.

DFAT 세포는 adipogenic, osteogenic, chondrogenic 및 neurogenic 계통을 포함한 여러 계통으로 성공적으로 재분화되었습니다2,3,6. 이 세포는 Nanog와 같은 여러 배아 줄기 세포 마커와 4 개의 확인 된 만능 인자 Oct4, c-myc, Klf4 및 Sox23를 발현합니다. 그들은 또한 세 개의 세균층7 각각에 특정한 마커를 발현합니다. 또한 DFAT 세포는 후성유전학적 특징에 따라 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM 유래 MSC)와 유사합니다3. DFAT 세포의 줄기세포 능력을 활용하여 많은 그룹이 다양한 질병을 치료하거나 개선할 수 있는 잠재력을 조사했습니다8,9. 심장 조직 손상, 척수 손상 및 요도 괄약근 기능 장애와 같은 병리학적 상태의 개선은 질병10-12의 쥐 모델에서 DFAT 세포 주입으로 관찰되었습니다.

DFAT 세포의 줄기세포 특성 외에도 지방 세포 생리학 연구를 위한 새로운 세포 모델을 나타낼 수 있습니다. 3T3-L1 세포주는 이러한 세포가 지방생성 자극(addipogenic stimulation) 하에서 부착성 지질 저장 지방세포로 분화하기 때문에 이러한 목적으로 자주 사용됩니다13. 그러나, 이러한 세포는 마우스 배아 조직(mouse embryo tissue13)에서 유래한다. 또한, 이 모델로는 디포 특이성을 조사할 수 없으며, 인간 지방세포 생리학을 완전히 반영하지 못할 수도 있다14. 다른 실험실에서는 쥐 지방 저장소에서 분리된 지방 세포를 연구하지만 쥐에서는 지방 분포가 이형성이 아니며 설치류의 복강의 해부학적 구성으로 인해 인간에게 직접 외삽할 수 없습니다15. 인간 비만의 생리병리학의 맥락에서 지방세포를 연구하기 위해서는 체지방 분포와 지방 디포에 따른 차이에 대한 고려가 필수가 되었다16. 지방 조직 생검 샘플에서 얻은 세포량과 배양에서 몇 번의 통과 후 노화를 포함한 1차 지방세포 배양의 몇 가지 한계로 인해 대체 모델이 필요했습니다. Perrini와 공동 연구자들은 내장 및 피하 지방에서 유래한 DFAT 세포의 유전자 발현에서 디포 특이성을 조사하고 이를 동일한 지방 디포의 지방 유래 줄기세포(ASC)와 비교했습니다. 그들은 세포 유형 간보다 창고 사이에서 주로 발견되는 유전자 발현과 기능의 차이를 입증했으며, 이는 DFAT 세포가 동일한 창고의 ASC에 생리학적으로 가깝다는 것을 시사합니다. DFAT 세포는 인간 비만의 병태생리학에서 지방 분포에 대한 연구를 위해 사용할 수 있는 모델에 대한 흥미로운 대안이 될 수 있습니다. 또한, 천장 배양은 조직 공학 목적으로 성체 줄기 세포를 얻을 수 있는 유망한 방법입니다.

여기에서는 피하 및/또는 내장 지방 샘플에서 성숙한 지방 세포를 분리하는 데 널리 사용되는 기술인 콜라겐분해효소 분해와 천장 배양을 수행하고 이러한 세포를 다분능 섬유아세포와 같은 세포로 역분화하는 후속 단계를 설명합니다17.

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프로토콜

윤리 문 :이 프로젝트는 이전에 환자 모집에 IUCPQ의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 이 문서 / 비디오의 목적을 위해, 우리는이 환자의 조직을 얻을 : 1) 57kg의 체질량 지수 50.7 kg / m 2, 2) 35 세 여자 환자의 BMI와 62 세 남자 환자 / 2, m. 실험은 모두 지방 구획하여 수행 할 수 있지만,이 동영상의 목적을 위해 하나의 지방 구획에 한정되어왔다. 비디오의 기술적 인 측면은 환자 1 수행하고 FABP4 면역 형광이 환자 세포로부터 분화를 수행 하였다.

1. 시료 처리

  1. 복강경 비만 수술시의 대망과 피하 지방 구획에서 지방 조직을 수집하는 외과 의사에게 문의하십시오.
  2. 빠르게 RT에서 실험실로 지방 샘플을 가져 즉시 처리합니다.
  3. 비 멸균 분위기에서, 실험실에서 소화를 수행합니다.결국 세포 배양실에 옮기고 멸균 조건 하에서 배양한다. 오염을 방지하기 위해, 소화 이전에 증류 여과 물 KRH 버퍼를 준비하고 여과 (0.22μM 필터)에 의해 수행합니다. 플라스크 및 플레이트 제조를위한 세포 배양 후드에서 에탄올 전에 전송으로 깨끗하게 청소 튜브.
  4. 사전 가중 요리와 기록 체중에 지방 조직을 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 적어도 24 시간 동안 실온에서 10 % 포르말린 버퍼 내의 각 조직 샘플 (이하 1cm 2)의 작은 조각을 고정. 면역 조직 화학 실험이 포함 된 샘플 (도시하지 않음 기술)를 사용합니다.
  5. (- 기술 도시하지 않은 예는, 유전자 발현)이 전체 지방 조직에 대한 자세한 연구를 위해 -80 ° C에 저장하기 전에 액체 질소에 50 ml의 튜브와 플래시 동결의 다른 조각을 놓습니다.

2. 콜라게나 소화

  1. 50 ㎖ TU의 나머지 지방 조직 조각을 배치소화합니다.
  2. 소화 관에 시료의 g 당 콜라게나 제 (350 U / ml)로 보충 KRH-WB의 4 ML을 추가합니다.
  3. 가위로 지방 조직을 말하다.
  4. 45 분 배양 (최대 1 시간)에 대한 통에 37 ° C, 90 RPM의 최대, 다진 지방 조직 서스펜션을 놓습니다.

지방 세포 Preadipocytes 3. 정제

  1. 플라스틱 비커에 메쉬 400 μm의 나일론을 통해 지방의 몇 덩어리 반투명 솔루션을 붓는다.
  2. 핀셋, 나일론 메쉬에 셀 준비를 문질러 KRH-WB 5 ㎖로 세척한다.
  3. 섬세 그것에 플라스틱 배관 및 배관 말단에 부착 된 60cc 주사기에 50 ㎖ 튜브에 여과 세포 현탁액을 전송합니다.
  4. 성숙한 지방 세포 현탁액으로 세포가 부상하여 버퍼의 상단에 도달 할 수 있도록 약 10 분간 방치하자.
  5. 천천히 60cc의 syrin를 사용하여 튜브의 하단에있는 버퍼를 대기음GE의 흡입.
  6. KRH-WB 20 ml의 세척에 추가. 2 추가 세척을위한 단계 3.4에서 반복합니다.
  7. 셀의 양에 따라, 5 또는 10 ㎖의 최종 부피로 지방 세포 현탁액을 가지고 수집 버퍼. 섹션 5에서 단계를 추구한다.
  8. 원하는 경우 상기 일차 세포 배양 용 원심 60cc 주사기 (3000 RPM, RT, 5 분)으로 수집 버퍼로부터 간질 혈관 부분을 복구 (기술은 도시 생략).

4. 성숙한 지방 세포의 세포 수

  1. 부하 계산 챔버 (혈구)에 부드럽게 흔들리고 지방 세포 현탁액의 10 μL. 4 번씩 세포 수를 수행합니다.
  2. 격리 된 성숙한 세포의 수를 계산합니다.

T-25 플라스크에 5 성숙한 지방 세포 탈분화

  1. DMEM / F12-20 %의 혈청을 사용하여 볼륨의 3/4 25cm 두 조직 문화 플라스크를 입력합니다.
  2. 세포 수에 따라, 플라스크 500,000 성숙한 세포를 붓는다.
  3. 완전 배지로 50ML 튜브를 사용하여 플라스크를 채우고 가능한 많은 거품을 제거한다.
  4. 플라스크에 환기가 안되는 캡 나사.
  5. 오염을 방지하기 위해 배양하기 전에 에탄올로 플라스크를 청소합니다.
  6. 세포의 흡착을 방해 할 수있는 문화 운동을 방지하기 위해 그것을 건드리지 않고 거꾸로 일주일 동안 플라스크를 품어.
  7. 역 문화 7 일에서 플라스크를 반전하기 전에 부드럽게 갑작스러운 움직임을 방지, 플라스크를 조작하고 흡인하여 플라스크에 모든 매체를 제거합니다.
  8. DMEM-F12-20 %의 혈청 12 ML을 추가하고 표준 기술을 가진 세포를 배양. 여과 벤트 캡 플라스크에 첨가 될 수있다.

6 웰 플레이트에 6 성숙한 지방 세포 탈분화

  1. 6- 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 배치 커버 슬립
  2. 각 커버 슬립 위에 ½ "플라스틱 부싱을 추가합니다.
  3. 20 % 송아지 혈청 DMEM 매체의 8 ml로 우물을 입력합니다.
  4. 각 플라스틱 부싱에 커버 슬립을 넣습니다.
  5. 슬라이드 및 슬라이드에서 세포를 주입하는 튜브 (물론 당 50,000 세포) 사이의 피펫 팁을 삽입합니다.
  6. 주 5 % CO 2, 37 ℃에서 표준 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트.
  7. 각 웰에 20 % 송아지 혈청 미디어 2 ㎖를 포함하고 추구하는 문화에 부착 된 세포와 역 커버 슬립.
  8. 세포가 면역 등 여러 가지 목적으로 탈분화를 겪고로 커버 슬립을 사용 (기술은 도시하지 않음).

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결과

주요 형태 학적 변화는 탈분화 (그림 1) 동안 지방 세포를 성숙 발생합니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 탈분화을받은 세포는 형광 분석을위한 안티 FABP4 항체로 염색 하였다. 섬유 아세포 유사 세포의 대부분은하지 않았다 반면 라운드 형태로 세포 FABP4 단백질 발현. 탈분화 후 DFAT 세포는 여러 통로위한 표준 절차를 재배 할 수있다. 우리는 인간 피하 장간막 DFAT 세포주 대 이상의 통로 (15)에 도달 할 수 있었다 (결과 미도시).

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사일 (B) 칠일과 문화. 사진의 12 일에 (C)에서에서 시간 (A)을 통해 성숙한 지방 세포를 dedifferentiating 그림 1. 형태론은 위...

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토론

천장 배양법 성숙한 지방 세포의 탈분화 네이티브 지방 조직의 작은 샘플로부터 지방 줄기 세포를 얻기 위해 새로운 방식이다. 경험 등 (2)의 기준, 1g 조직은 25 cm-2 플라스크 판형하고 균질 Poloni 협력자 (3)에 의해 입증되었다 DFAT있는 세포 집단을 수득하기에 충분하다. 지방 세포의 탈분화는 독립적으로 연령, 성별 및 기타 특성, 어떤 기증자 세포 가능한 것 같다. DFAT는 얻어진 결과 인구 중 거의 원형 또는 완전히 탈분화하지 않은 연장 된 셀이 부분적으로 남아있다. 그들은 트립신 미디어 믹스에 떠 이러한 세포는 일반적으로 문화의 통로를 통해 삭제됩니다.

이러한 세포의 다 능성 설립 및 세포 치료 2,3에 대한 사용을 지원합니다. 높은 증식 능력은 또한,보고 된 I줄기 세포 응용 프로그램 2 세포 배양의 SA 가치 측면. DFAT 인간 세포 연구와 그들의 복...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant, 371697-2011, AT)의 지원을 받았습니다. 저자는 비만 외과 의사 S. Biron, F-S. 박사의 도움에 감사를 표하고 싶습니다. IUCPQ 조직 은행의 Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, Christine Racine과 Caroline Gagnon. 비디오 촬영 및 편집에 대해 IUCPQ 시청각 서비스의 Mr Jacques Cadorette에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민시그마A7906
아데노신시그마A4036
아스코르브산시그마A0278
NaCl모든 브랜드 사용 가능
KCl모든 브랜드 사용 가능
CaCl2모든 브랜드 사용 가능
MgCl2모든 브랜드를 사용할 수 있습니다
KH2PO4모든 브랜드를 사용할 수 있습니다
HEPES모든 브랜드를 사용할 수
포도당모든 브랜드를 사용할 수 있습니다
Type I 콜라겐 분해 효소Worthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, 페놀 레드 없음Gibco-Life Technologies11039-021배지에 첨가 : 20 % 송아지 혈청, 겐타 마이신 (50 µ g/ml) 및 fungizone(2.5 µ g/ml)
송아지 혈청, 철분 보충, 분유 사육 송아SigmaC8056-500 ml
1/2 In 플라스틱 부싱Iberville2704-CPSKU:1000120918 (Home Depot)
액체 질소Linde
Formalin soluton, 중성 완충, 10%SIGMAHT501128
멸균 핀셋
멸균 가위
60cc 주사기BD 주사기
플라스틱 튜브
Krebs-Ringer-Henseleit 스톡 버퍼(KRH)다음과 같이 스톡 버퍼를 준비합니다: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. pH를 7.4로 조정합니다.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)다음 성분을 KRH 완충액에 새로 첨가하십시오 : 4 % 소 혈청 알부민, 5 mM 포도당, 0.1 µ M 아데노신, 560 &마이크로; M 아스코르브산
KRH-WB, Type I 콜라겐 분해 효소350 U/ml의 Type I 콜라겐 분해 효소
T25 비환기 캡 조직 배양 플라스크Sarsted 또는 기타 브랜드
6-well 조직 배양 플레이트BD Falcon 또는 기타 브랜드
의 현미경 커버 유리 22x22Fisherbrand12-542-B
멸균 비커
있습니다 지 첨가, , 의 ,

참고문헌

  1. Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
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  13. Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
  14. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  15. Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
  16. Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
  17. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
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