방법 논문

Zebrafish의 각막 실질 세포의 Explants는 피부 상처 치유에 집단 셀 마이그레이션 및 재 상피화을 연구하는

DOI:

10.3791/52489

⸱

2015년 2월 25일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences Program, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Midwestern University

이 논문에서

요약

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Zebrafish의 각막 간질 세포는 외식에서 세포 시트에서 마이그레이션 상피 상처 치유의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘 연구를위한 체외 모델을 제공합니다. 이러한 프로토콜 세부 집단 세포 이동 분석에 사용하기위한 기본 이식편 배양 물을 확립 할 수있는 효과적인 방법.

초록

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때문에 고유 운동성 특성, 물고기 각막 간질 세포가 이식편 문화가 긴 하나의 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다에서 해리. 운동의 빠른 속도, 수직 굴지의 케이블로 광범위한 액틴 풍부한 라멜라, 비교적 일정한 속도 : 외식이 설정되어 그러나,이 세포는 개인이 마이그레이션 연구하는 매력적인 모델을 각막 간질 있도록 많은 기능을 유지, 집단적으로 이동 이주의 방향. 초기 이식편에서, 집합 적으로 이러한 마이그레이션 마이그레이션 개별적 세포의 신속한 상호 마이그레이션의 모드를 결정하는 단계에서 세포 - 세포 유착의 역할에 대한 연구를 허용하고, 이동의 두 모드 사이 분자 링크를 강조한다. 중간 엽 전환에 상피가 발생하여 상처 치유 및 염증과 관련된 유전자가 발현 된대로 나중에 절편의 세포는 신속하고 집단적으로 마이그레이션 할 수있는 능력을 상실. 따라서, 각막 이식편은 피부 상처 치유 중에 발생하며 유전자 발현 변화 정의 프로그램의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 독특한 시스템을 나타낼 수 상피화위한 시험 관내 모델이 될 수있다. 돌연변이 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 다양한 사용할 수 있습니다 외식 서로 다른 유전 적 배경을 가진 물고기를 설립 할 수있다. 이는 이들 공정 내에서 다른 단백질의 고유 역할 해결 될 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 집단 세포 이동과 관련된 다양한 분석법에 사용하기 위해 이들 체외 이식편 배양 물을 형성하기위한 간단하고 효과적인 방법을 설명한다.

서론

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세포 운동성의 연구는 전통적으로 개별적으로 마이그레이션하는 세포에 초점을 맞추고있다. 물고기와 양서류 외식에서 배양 된 각막 간질 세포는 1-6 접근 실험과 수학적 모두 모델링을 사용하여 세포 운동성의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력한 모델 시스템을 입증했다. 균일 한 형상, 속도 및 방향을 유지하면서 개별적 세포 이주에 대한 실험은 세포의 빠른 부드러운 글라이딩 운동에 의해 도움을 받는다. 특히 배아, 상처 치유 및 전이 과정, 세포 - 세포 접합을 유지하면서 그러나, 생체 내에서 세포 자주 집단적으로 이동합니다. 따라서, 집단 세포 이동은 세포 이동의 분야 내에서 연구의 성장과 점점 더 눈에 띄는 지역이다. 이러한 세포의 집단 이주는 최근 7을 설명하고 그것이 상처 치유 모델에서 집단 세포의 이동을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 만들어 많은 독특한 기능을 가지고 있습니다.

ove_content "> 비늘이 마취 성인 지브라 피쉬로부터 축출 될 때, 어떤 상피 조직은 규모의 밑면에 부착 된 상태로 유지. 세포 배양 배지가 첨가되고, 이들 상피 세포 또는 각막을 스케일에서 집단 단위로 급속하게 이동한다.을 절편 배양 세포들이 손상 상피을 다시 침대 상처의 임시 매트릭스에 걸쳐처럼 절편에서 멀리 이동하는 상피 상처 치유 모델로 볼 수있다. 최근 데이터가 제안이 체외 배양 모방의 많은 기능이 생체 내에서 성인 제브라 피쉬 상처 치유. 상처 봉합 률 8 생체 시스템 (7)에서 관찰 된 것과 유사한 이동 속도를 번역. 또한, 생체 내 상처 모델 치유, 와파린 치료 지혈이 속도에 영향을 미치지 않는다는 점을 시사 하이드로 코르티손과 치료 면역 반응을 감소시키는 동안의 치유, 재 상피화 8을 지연시키지 않는다 SUP. 규모가 동물로부터 제거 될 때 출혈 지브라 피쉬하지 않으므로, 지혈 주요 플레이어 아니다. 우리가 외식에 면역 세포를 발견했지만, 우리는 그들이 집단 세포의 이동에 미칠 수있는 영향을 연구하지 않았습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 많은 생물학적 분석에 사용 일관성과 재현성을 보장 제브라 피쉬 각막 이식편 문화를 구축하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절편 문화는 여러 가지 이유로 집단 세포의 이동에 대한 체외 모델에서 특히 매력적인 있습니다. 첫째, 제브라 피쉬의 각막 간질 세포가 이식편 문화를 확립 시간 이내에 사용 일차 전지이다. 따라서, 이들 세포는 일차 전지 9-13의 통로와 관련된 형태 학적 및 유전자 발현 변화를 겪은 않았다. 둘째로,이 시스템은 상처에 대한 반응, 간엽 TR에 상피의 일부로서, 14 부상에 응답 상피화의 연구를위한 모델을 나타내고유전자 발현의 변화 및 세포 골격 재 배열 (14,15)에 의해 입증 ansition (EMT) 프로세스가 시작된다. 따라서, 처리하지 않은 세포에서 발생하는 유전자 발현 및 운동의 배경 변경 특징 및 치료와 변화를 해석하는 컨텍스트를 제공하고있다. 또한, 물고기 간질과 인간의 각질 세포는 기능적으로 동일; 모두는 각 종의 기본 상피 세포이며 상피 상처 치유에 중요한 역할을한다. 셋째, 성인 제브라 피쉬는 흑색 종 및 기타 암 19 ~ 21, 8, 14 및 조직 재생 22-24 치유 피부 상처를 포함하여 인간의 질병 16-18의 다양한 모델 시스템으로 인정 받고있다.

이 모델 시스템의 기술적 인 장점은 동일하게 강력한이다. 돌연변이와 유전자 변형 라인의 증가는 비영리, 중앙 집중화 된 시설에서 사용할 수 있습니다. 특히, Zebrafish의 돌연변이 프로젝트 (ZMP) 웰컴 트러스트 생어 연구소에서는 제브라 피쉬 게놈 유전자를 코딩 모든 단백질 녹아웃 대립 유전자를 작성하는 것을 목표로하고있다. 현재, 이들은 24,088 대립 특징으로 11,892 유전자, 게놈의 약 45 %의 변이있다. 또한, ZMP는 제안을 받아 무료로 녹아웃을 생성합니다. 애벌레와 성인 zebrafish의 25 ~ 28 유전자 최저의 최근 방법은 형질 전환 방법에 문제 또는 실용적이지 않은 발달 중요한 유전자의 기능을 연구 할 수있는 유연성을 제공한다.

~ 145 μm의 / hr의 운동성 자신의 매우 빠른 속도로 인해 곧 문화 (29)의 설립 후, 분석은 (일반적으로 24 시간 이내에) 신속하게 완료 할 수 있습니다. 실험은 신속하게 종료하고 배양, RT에서 잘 비디오 현미경을 포함하는 포유 동물 세포 이동 분석법이 회피와 관련된 몇몇 기술적 장애물을 재배 할 수있다. 또한, 연구 예산을 긴축의 시대에, zebraf틱은 쉽게 저렴하게 유지됩니다.

이식편의 구조 및 동작은 복잡하다. 스케일이 제거 될 때 출혈 물고기가 없기 때문에, 그것은 표면 상피층보다 훨씬 더 스케일 제거되는 것 같지는 않다. 세포의 대부분이 안티 E-cadherin의 항체 (14) 염색 나타나는 규모가 처음 물고기에서 제거 될 때 각막 간질 세포는 이식편에서 지배적 인 세포 유형으로 나타납니다. 또한, (14)에 의해 면역 염색 멘틴의 부재로 판단 초기 배양 섬유 아세포의 증거는 없다. 그러나 반복 스케일 제거와 함께, 이식편 수많은 호중구있을 표시 (비디오 1 참조). LPS에 노출 될 때 우리는 그 크기, 급속 운동성 및 세포 시트 점 이동의 형태 학적 관찰에 기초 호중구 이들 세포를 확인 하였다 (데이터는 보이지 않음). 또한 이러한 세포는 밝은 지혜를 얼룩호중구 세포질 인자뿐만 아니라 그들과 그 표면에 풍부한 FcR에있는 것을 나타낸다 IgG를 이차 항체의 다양성에 항체 (데이터 미기재) H. 여러 세포층 이식편 내에 존재한다. 초점 현미경을 위, 아래, 및 간질 세포 시트 사이 보이는 호중구와 스케일 근처 각막 2 층 이상에 전연 근처 단층의 존재를 드러낸다.

이른 시점에서, ~ 145 μm의 / hr의 초기 속도에서 각막 이식편에서의 집단적인 이동을 개시하는 다층 이식편을 편광의 에지에서 셀. 이식편 적용 지역은 급속하게 증가 시트 내에서 긴장을 확산 셀에 선도하고, 최첨단의 사전의 감소 속도. 지도자와 추종자 세포 사이의 빠른 상호 전환은 시트 (7) 내에서 자발적으로 형성된 구멍의 형성과 폐쇄시 첨단에서 관찰된다. 로절편으로 시작 EMT 과정은 시트 조각과 각막 자신의 전문, 빠른 운동성을 잃고 계속. 유전자 발현 및 EMT와 일치하는 형태 학적 변화, 상처 치유 및 염증 반응은 외식이 약 십일 (14)에 대한 실행 가능한 것으로 간주되는과 문화의 7 일 이내에 발생합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 AVMA 동물 복지 원칙을 준수 중서부 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

마취, 장비, 및 미디어의 1. 준비

  1. 상업 탈염 제 (애완 동물 상점에서 구입 가능) 또는 24 시간 동안 물 받침대를 시켜서 하나를 사용하여 수돗물의 약 1.5 L를 탈염 소화. 세 1 L 비커를 확보하고 물 탈 염소 500 ml의 각을 입력합니다. 모든 절차 전에 물고기를 잡고 하나 및 복구를 위해 하나의 레이블. 세 번째 비커에, tricaine 메탄의 100 ㎍ / ㎖의 추가; 이것은 물고기는 마취 될 것이다 비커된다.
  2. 배양액을 따뜻하게, 얼음으로 얕은 트레이 채우기 (RPMI 1640, 10 % FBS (소 태아 혈청), 50 μg의를 / ㎖ 겐타 마이신, 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 25 mM의 HEPES) RT, 그리고 깨끗한 보석의 족집게를 수집합니다. 임멜으로 청소 핀셋70 % 에탄올에 팁을 노래하고 에탄올 연소 할 수 있도록, 분젠 버너를 통해 전달합니다.
  3. 10 배 확대, 또는 현미경 (개인 취향에 전적으로 의존)을 해부 - 프로 시저가 2 상업, 탁상 조명 돋보기, 확대없이 수행 될 것입니다 여부를 결정합니다.

2. 이식편 문화 구축

  1. 유지 비커에 물고기와 장소의 수를 잡아라. 마취 비커에 하나의 물고기를 이동; 개별적으로 물고기를 마취하는 것이 가장 좋습니다.
  2. 물고기의 수영과 아가미의 움직임을 관찰하여 마취의 효과를 모니터링합니다. 마취가 진행됨에 따라, 아가미 운동은 느려지고 물고기는 불규칙하게 자주 거꾸로 헤엄; 즉시 아가미 운동 중단으로 마취 물고기를 고려한다. 이 물고기의 사망을 초래할 수 있으므로 마취 욕조에서 오랜 기간 동안 물고기를 두지 마십시오.
  3. 마취 비커 및 전송에서 물고기를 제거얼음, 핀셋을 잡는 손에 대향 꼬리 가로 배치 물고기. 기법 및 여러 경우가 발생하면 물고기, 이식편을 이때 마취 비이커에 다음 물고기를 배치하는 데 사용되는 것을 고려하여야한다.
  4. 비늘을 제거하려면, 위치 핀셋 규모의 가장자리에 끝이 물고기에 평행. 스케일이 물고기의 몸에서 상승의 원인이 약간 물고기의 측면에 핀셋의 평평한면을 밟아. 조직 배양 접시에 핀셋, 당기기, 그리고 (반전 없음) 장소와 규모를 잡고. 아가미 지역, 측면 라인, 그리고 핀을 피하고, (각 측면에서 6) 큰 성인 12 스케일의 최대 제거 절차를 반복합니다.
  5. 복구 비커에 물고기를 배치하고 마취의 영향에서 회복하기 위해 모니터링 할 수 있습니다. 이때, 물고기 개별 탱크로 다시 전송 될 수있다. 물고기가 완전한 규모의 재생을 허용하기 위해 최소 21 일 동안 복구 할 수 있습니다.
  6. 에 따라유리 바닥 접시 당 6 저울 - 실험 설계, 플라스틱 35mm 조직 배양 처리 접시 당 20 저울 또는 최대 4 놓습니다. 저울 접시에서 스케일을 분리하지 않도록 부드럽게 용지를 추가하기 전에 접시에 부착 할 수 있습니다.
    주 : 매체가 제 접시에 첨가되기 전에 경험, 여러 물고기 처리 될 수있다.
  7. 각 35mm 접시에 완전한 미디어 (위의 1.2 참조)의 1.2 ML을 추가합니다.
  8. 바람직하게 또는 추가 처리없이 시간의 원하는 기간 동안 5 % CO 2에서 28 ° C에서 이식편 문화를 배양한다. 대안 적으로, 가열 스테이지 상 현미경 또는 비디오 현미경 생균 배양 챔버 내에 배양 부화.

3. 브라이트 및 비디오 현미경

  1. 처음 현미경 무대에 세포 시트를 포함하고 위치 요리는 4 배 대물 렌즈를 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
    주 : 높은 배율은 실험에 따라 사용될 수있다. 의 위치를​​ 표시각 셀 시트 및 / 또는 무대에서 접시의 방향은 거의 같은 방향으로 시트와 함께 시간이 지남에 촬영에 용이합니다.
  2. 각 실험 프로토콜에 따라, 다양한 시점에서 인큐베이터와 사진에서 요리를 제거하고 만 정지 영상이 실험 기간에 걸쳐 필요한 경우 인큐베이터에 다시 배치합니다.
  3. 비디오 현미경을 수행하는 동안, 다음에 주목 :
    1. 마이그레이션 세포 시트는 비디오의 지속 기간을 위해 시야에서 잔존하도록 시야 내의 스케일 / 신흥 세포 시트를 배치.
      참고 :이 세포가 규모에서 마이그레이션하는 방법을 관찰하는 경험이 걸릴 수 있습니다. 짧은 동영상의 경우, 이것은 더 이상 동영상에 대한보다 우려의 적습니다.
    2. 짧은 시간 프레임의 경우, RT에서 품어. 더 긴 시간 프레임들 (18+ HR)의 경우, 가열 단계 또는 온도를 유지하기 위해 배양 챔버, PH 농도를 사용하여 배양 m의 증발을 최소화edium.

면역 형광 현미경 4. 고정

  1. 준비하고 28 ° C까지 사전 따뜻한 모든 솔루션을 제공합니다. 형광 하에서 각막을 볼 유리 바닥 35mm 조직 배양 접시를 사용하여 상기 한 바와 같이 체외 이식편 배양 물을 성장시키기 위해. 또한, 유리 챔버 슬라이드를 사용합니다.
  2. 각각의 접시에 1.1 배 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 0.8 ML을 추가합니다. 먼저 문화 매체를 제거하지 마십시오. 5 분 후, 용액을 흡인 제거하는 동안 실온에서 인큐베이션.
  3. 각각의 접시에 1.1 배 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 0.8 ML을 추가합니다. 5 분 후, 용액을 흡인 제거하는 동안 실온에서 인큐베이션.
  4. 1X PBS 0.5 ml의 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가함으로써 외부 리간드 또는 외부 에피토프 Permeabilize 하시려면 세포를 사용하지 않을 경우. 5 분 후, 용액을 흡인 제거하는 동안 실온에서 인큐베이션.
  5. 1X PBS 0.5 ml의 1 % BSA를 추가하고 (4 ° C에서) 1 (실온에서) 시간 또는 O / N 동안 품어.
    주 : 실험 조건에 따라, PHAlloidin를이 단계에서 첨가 될 수있다.
  6. 배양 후, 흡인은 용액을 제거하고 항체 염색을 진행합니다. 4 ℃에서 3-4주 위해 1X PBS에 1 % BSA 2 ㎖ - 대안 적으로, 적어도 하나를 첨가하여 배양 접시를 저장한다.

5. 면역 형광 프로토콜

  1. 제조업체의 권장 사항에 따라 기본 및 보조 항체 솔루션을 준비합니다.
    참고 : 제조업체의 권장 사항을 사용할 수없는 경우, (1X PBS에 1 % BSA)에 차 항체의 좋은 시작 희석 1 : 클론 500 및 1 : 단일 클론 항체 1000; 이차 항체에 대한 좋은 시작 희석 1 : 1000. 신호가 강하고 배경에 문제가있는 경우 신호가 낮은 약한 경우 더 높은 제조업체에서 얻은 원래 주식이 희석을 조정합니다.
  2. 1X PBS 용액 1 % BSA를 기음. 일차 항체 솔루션의 0.5 ML을 추가 (4 ° C에서) 또는 O / N (실온에서) 1 시간 동안 배양한다.
  3. , 차 항체 용액을 제거 배치 깨끗한으로 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 표시하고, -20 ℃에서 동결.
    주 : 필요한 경우, 차 항체의 재사용을 허용한다.
  4. 제거하고 각 세척 후 PBS를 폐기, 1X PBS로 5 회 - 요리 3을 씻으십시오.
  5. 이차 항체 솔루션의 0.5 ML을 추가합니다. 원하는 경우,이 단계에서 (모든 제조업체에서 권장하는 농도 다음) 형광 표지 팔로이 딘을 추가합니다. (4 ° C에서) 또는 O / N (실온에서) 1 시간 동안 품어.
    참고 : 사용 팔로이 딘 형광 표지는 액틴 필라멘트의 시각화 할 수 있습니다; 우리는 488 표지 팔로이 딘이 우리의 제브라 피쉬 각막에 가장 적합한 것을 발견하지만, 다른 형광 물질을 사용할 수있다.
  6. 제거하고 차 항체 솔루션을 폐기합니다.
  7. 제거하고 각 세척 후 PBS를 폐기, 1X PBS로 5 회 - 요리 3을 씻으십시오.
    참고 : 접시는 4 ° C 경쟁 할 수없는 경우에, 빛 덮여, 저장 될 수있다바로 w; 확인 1X PBS는 세포가 있지만 따뜻한 RT에 건조하지 않도록하기 위해 보관하기 전에 접시에 추가되어 있는지 확인 (20-30 분), 후 바로 전에 다음 단계로 진행하기에 PBS를 제거합니다.
  8. 접시에, 실험의 필요에 따라, 또는 DAPI하지 않고, 설치 매체의 3 방울 및 실온에서 10 분 동안 앉아 보자 - 준비가 관찰 할 때, (2)를 추가합니다.
    주 : 우리는 DAPI와 시판, 글리세롤 계 장착 매체를 사용하지만, 다른 미디어를 장착 할 수 있습니다. 접시에 앉아 장착 매체 10 분을 허용하면 접시의 바닥에서 유리 커버 슬립 쉽게 제거를 용이하게한다.
  9. 배양 후, 부드럽게 풀고 커버 슬립을 제거하기 위해 접시의 측면에 짜. 슬라이드에, 아래로, 세포를 유리 슬라이드에 장착 미디어의 추가 하락을 추가하고 coverslip에 배치합니다.
    참고 : - 2 일 슬라이드 이상 1 보관해야하는 경우 분명 손톱 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉 고려하십시오.
  10. 형광 현미경 슬라이드를 관찰합니다.
    주 : 우리는 대부분의 이미지 오일 침지 아래 또는 40X 63X 대물 렌즈를 이용하여 촬영 한하지만 특정 대물 렌즈는 실험 프로토콜 사용에 의존 할 것이다.

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결과

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도 1에 도시 된 바와 같이, 각막 이식편 시트 배양을 설정 시간 이내에 스케일 아래로부터 이주 관찰 될 수있다. 때때로, 집단적으로 마이그레이션 시트에서 떨어져 고장이 개별적으로 마이그레이션 각막 간질 세포는 관찰 할 수있다. 이식편 이전 뽑아했다 물고기에서 설립되었습니다로 또한, 시트를 통해 마이그레이션 풍부한 호중구가있다. 긴 배양 기간에서 세포와 같은 각막 시트 단편 EMT 14 겪는다.

시트 발전의 초기 속도는 매우 빠른하지만이 속도는 빨리 문화의 첫 48 시간 (그림 2A-C) 중 (~ 3.1 각각 배 ~ 1.8 증가 영역과 핵간 거리 측정) 세포 확산으로 느려집니다. 급속한 증가는 세포 증식과 연관되어 있지; (형광 티미 딘 유사체 티닐 옥시 우리 딘 24 시간 동안 라벨링 후에듀가) ~ 세포의 10 %가 세포 분열의 증거를 보여, 속도 형질 전환 된 세포 라인에서 볼 수 있지만, 인...

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토론

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배지의 첨가 전에 3 분 - 각막 이식편 배양의 성공을 위해 가장 중요한 단계는 스케일이 약 2 배양 접시에 부착 할 수있게된다. 비늘의 약 75 %가 부착하고 (각 실험에 대해 확립 된 배양의 수는 적절히 조절 될 필요가있을 것이다) 시트를 성장할 것이다. 각막 실질 세포 시트는 물고기에서 제거하고 여러 가지 이유로 문화에 배치 모든 규모의 주위에 형성하지 않는다. 첫째, 외식의 DAPI 염색 일부 규모가 몇 세포가 부착 된 것을 알 수 및 따라서 이러한 스케일은 각막의 시트가없는 것으로 예상된다. 둘째, 조직 배양 접시에 부착 이식편의 능력은 시트 마이그레이션의 필수 전제 조건이다. 설립 저울이 부착 여부를 결정하는 핵심 성공적인 이식편 문화는 성장 표면과 미디어의 추가의 규모를 배치 사이의 시간입니다. 미디어없이 준수하기에 불충분 시간 floatin 저울로 이어질 것너무 긴 기간 (판매의 가장자리에 가시 세포 잔해와 절편의 건조에 아마도 때문에)없이 성장 부착 스케일 발생합니다 동안 미디어에서 g (때로는 눈에 보이는 조...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 연구 촉진 그랜트 EEH 연구의 중서부 대학 Office 및 교내 그랜트 KJL에게 수여 스폰서 프로그램에게 수여 보건 과학 중서부 대학에서 기금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35mm 유리 바닥 배양 접시(Poly-D 라이신 코팅)MatTekP35GC-1.5-14-C1.5mm 두께가 커버슬립 제거에 가장 적합합니다. 14mm 직경은 더 많은 배양 면적을 제공합니다.
스위스 보석상 스타일 펜셉트, Integra, Miltex 17-303VWR21909-460우리는 좁고 미세한 펜셉이 스케일 제거에 가장 적합하다는 것을 발견했습니다.

참고문헌

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