방법 논문

추 잠재적 가뭄 내성 세미 높은 처리량 검열 ( 왕 고들빼기 속 sativa로구나) 유전자 원의 컬렉션

DOI:

10.3791/52492

⸱

2015년 4월 17일

 , 
1Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 생리학적, 분자적, 유전학적 연구에 사용할 작은 양상추 후보 풀을 식별하기 위해 잎이 많은 채소 상추(Lactuca sativa L.)의 대규모 생식질 수집을 가뭄에 대한 내성을 검사하기 위해 개발되었습니다.

초록

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이 프로토콜은 잎이 많은 녹색 채소 상추(Lactuca sativa L.) 생식질의 대량의 집합체를 대상으로 가뭄 내성 형질이 있는지 검사하는 방법을 설명합니다. 농업용 담수 가용성은 미국뿐만 아니라 전 세계 많은 지역에서 점점 더 우려되고 있습니다. 물 가용성 조절에 대한 규제 개입과 함께 단기적인 가뭄 현상이 발생하고, 많은 주요 농업 지역에서 강수량 감소로 이어질 수 있는 장기적인 기후 변화의 위협이 증가함에 따라 향후 몇 년 동안 생산을 유지하거나 확장하기 위해 물 사용 효율성 향상에 적합한 작물 개발을 서두를 필요성이 높아졌습니다. 이 프로토콜은 상추의 생리학적 또는 분자 수준에서 가뭄 내성 특성을 식별하기 위한 단계별 지침이 아니라 수천 종의 다양한 상추 품종을 선별하여 개발 및 개선된 방법입니다. 이 스크린의 특성은 부분적으로 세 가지 수분 스트레스 지표, 즉 잎의 상대 수분 함량, 시들음, 가뭄 스트레스에 따른 차등 식물 성장에 초점을 맞춘 간소화된 측정을 기반으로 합니다. 대규모 생식질 채취를 신속하게 스크리닝하는 목적은 실험실이나 현장에서 특정 가뭄에 강한 형질을 식별하기 위해 보다 집중적인 생리학적, 분자적, 유전적 방법을 적용할 수 있는 지점으로 후보 풀을 좁히는 것입니다. 후보자는 또한 가뭄에 대한 내성 특성의 원천으로 육종 프로그램에 직접 통합될 수 있습니다.

서론

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>jove_content<관개를 위한 물 가용성은 수십 년 동안 미국 전역과 전 세계적으로 우려 사항이었지만, 다른 비생물적 스트레스와 함께 가뭄 스트레스에 대한 대응에 대한 연구는 주로 자금 부족으로 인해 산업, 학계 및 정부 수준에서 질병 및 곤충 저항성 분야의 연구보다 뒤쳐져 있습니다. 농업을 위한 물 가용성은 역사적으로 정책 입안자 수준에서 부차적인 고려 사항이었습니다. 최근 미국과 호주의 주요 농업 생산 지역에서 몇 차례의 심각한 가뭄으로 인해 국내 및 국제 차원에서1,2 개의 담수 가용성이 주목을 받았으며, 이로 인해 주요 곡물 작물의 가뭄에 강한 품종을 개발하기위한 연구에 더 많은 자원이 투입되었습니다. 가뭄에 강한 주요 작물의 개발로 초점을 전환하는 것은 유익하지만, 많은 식물 연구 분야와 마찬가지로 특수 작물은 대체로 뒤처져 있습니다.

현재 미국에서 가장 큰 양상추 생산 지역인 캘리포니아에서 극심한 가뭄으로 채소 생산이 제한되고 있습니다3. 이러한 단기적인 날씨 패턴은 입법 및 사법 조치와 함께 장기적인 기후 변화4,5와 결합되어 캘리포니아에서 가장 생산적인 많은 지역에서 농업에 사용할 수 있는 물을 감소시켰습니다. 캘리포니아의 양상추 생산은 15억 달러 규모의 산업으로 미국 양상추 생산량의 약 80%를 차지합니다3. 잎이 많은 채소는 잎의 수분 함량이 높고, 특히 상추는 뿌리가 얕아6,7 작물이 수분 스트레스에 취약합니다. 모든 작물과 마찬가지로 상추의 경우, 관개를 위한 담수 공급이 더욱 제한됨에 따라 가뭄에 강한 품종의 개발이 점점 더 중요해질 것이다8.

이 프로토콜은 특정 가뭄 내성 형질을 식별하기 위한 생리학적, 분자적, 유전학적 연구에 사용하기 위해 잠재적으로 가뭄에 잘 견디는 후보 계통 풀을 식별하기 위해 대량의 양상추 생식질 컬렉션에 대해 초기 스크리닝을 수행하는 방법을 제시합니다. 이러한 후보는 또한 상업용 품종의 물 사용 효율성을 개선하기 위해 육종 프로그램에서 가뭄 내성의 원천으로 직접 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 광범위한 생식질 수집의 모든 스크리닝 과정에서 발생하는 문제, 특히 공간 가용성 및 노동력 문제를 해결하기 위해 특별히 개발되었습니다. 또한, 제시된 프로토콜은 상추에 사용하기 위해 개발되었지만, 잠재적인 가뭄에 대한 시금치(Spinacia oleracea)의 생식질 수집을 스크리닝하는 데 사용하도록 성공적으로 조정되었으며 단순히 모든 잎이 많은 채소 작물을 스크리닝하기 위해 수정될 수 있습니다.

가뭄 내성 검사를 시작하기 전에 고려해야 할 중요한 사항은 이 방법이 무엇인지 그리고 무엇이 아닌지 이해하는 것입니다. 이 프로토콜은 개별 내성 형질을 식별하기 위한 보다 집중적이고 철저한 연구에 사용하기 위해 관리 가능한 수의 후보 생식질로 대규모 생식질 풀을 빠르고 효율적으로 좁힐 수 있는 신속한 방법을 나타내기 위한 것입니다. 이 프로토콜은 밭 조건에서 관찰되는 보다 자연스럽고 천천히 유도되는 중간 정도의 지속적인 가뭄 스트레스와 대조적으로 식물에 빠르게 유도되는 심각한 물 스트레스를 가합니다. 이 두 가지 유형의 물 스트레스 사건(급격한 탈수 대 자연 가뭄) 동안 식물 내에서 유도된 반응 유형은 동일하지 않으며9 이는 향후 시험에서 일부 물질을 제외시킬 수 있습니다. 이 두 가지 스트레스 이벤트는 중복되지 않으며10 이 프로토콜은 대규모 컬렉션에 포함된 잠재적으로 가뭄에 강한 생식질을 식별하는 효과적인 방법으로 작용해야 합니다. 이 프로토콜만으로는 밭의 물 스트레스 조건에서 지속적인 가뭄 내성을 포함하는 높은 수준의 확실성 생식질을 식별하기에 충분한 것으로 간주되어서는 안 되지만, 잠재적인 가뭄 내성 형질에 대해 잎이 많은 녹색 채소를 신속하게 선별하는 데 있어 중요한 진전을 나타냅니다.

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프로토콜

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1. 심기

  1. 플러그 트레이 채우기 (128 셀; 3cm 사각형 셀 28 X 54cm와 5cm 깊이) 플러그 토양 믹스. 세포의 균일 한 충전에 도움이 빈 플러그 트레이를 사용하여 각 트레이에 흙을 압축합니다.
  2. 식물 상추 씨앗 ¼ 깊이 셀 당 2 ~ 3 씨앗 인치. 식물 복제 트레이에있는 모든 실험 선은 가뭄 모두 스트레스와 가뭄 재판 제어 트레이를 제공합니다.
  3. 구멍이없는 바닥 판에 플러그 트레이를 놓습니다.
  4. 반전 트레이 또는 플라스틱 돔 물 트레이 커버. 발아는 일반적으로 48 ~ 72 시간에 발생합니다. 발아 후 덮개를 분리하고 온실에 트레이를 이동합니다.
    참고 :이 프로토콜은 또한 성장 챔버에서 수행 될 수있다.

2. 성장과 식물 케어

  1. 발아 후 1~4주 필요에 따라 물 트레이, 일반적으로이 땅을 하단 트레이를 채우고 수 있도록하여, 2 ~ 3 회 (매주)는 오랜 시간 동안 앉아 (~ 1 시간) 광선 포화되기 위해이 같은 물에서의 부정적인 식물의 건강과 루트 개발에 영향을 미칠 수 있으며, 가뭄 화면에 영향을 줄 수 있습니다.
  2. 1.5 작은 술 / 여자의 비율로 혼합 상업적 가용성 20-20-20 비료와 함께 매주 한 번 용지함을 기름지게.
  3. 세포 1-2주 당 하나의 공장 얇은 트레이는 발아를 게시합니다.

3. 시작 가뭄 스트레스

  1. 식물은 2 그룹으로 사주 된 별도의 트레이는 경우. 심각한 물 부족에 따라 하나의 그룹. 뿐만 아니라 컨트롤을 물을 다른 용지함을 사용합니다. 실험을하는 단계 2.1에서와 같이 대조군 물. 가뭄의 시작에서 실험의 나머지 부분에 대한 모든 트레이 시비 일시 중단합니다.
  2. 실험 가뭄 1 주일 기간에 걸쳐 발생한다. 가뭄 스트레스 시험 (0 일)의 첫 날에 물과 그 이하의 모든 트레이를 작성하고 플러그 트레이에 토양이 다음 완전히 포화 될 트레이에서 물을 배수 할 수 있습니다. t의 개시 직전에 토양을 포화그는 스트레스 기간은 플러그 트레이에 개별 셀 사이의 토양 수분에 어떤 변화를 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.

매개 변수와 기본 가뭄 스트레스 화면을 실시 4. 측정한다

주 : 다음 단계는 표 1은 가뭄 스트레스 시험 기간의 각각의 날에 측정 된 값의 일정을 제공한다 가뭄 화면의 과정을 통해 기록되는 세 가지 생리 학적 측정을 수집하는 방법을 설명합니다.

  1. 일 0, 2, 재판의 4 잎 상대 수분 함량 (RWC)을 측정한다.
    1. 트레이에서 양상추 식물 클립 및 2 잎을 제거합니다.
    2. # 9 코르크 천공 충 (~ 1.6 cm 직경)를 사용하여 각각의 잎에서 3 디스크를 펀치. 하나의 샘플로 잎 펀치를 결합합니다.
    3. 잎 디스크를 달아이 RWC 계산에 사용 생체중 (FW) 값이고, 다음 페트리 접시에 디스크를 배치했다.
    4. 모든 판에 충분한 증류수를 추가아야 모든 잎 디스크는 떠 있습니다. 이것은 완전히 RWC 분석을 위해 과장된 가중치를 수집하기 위해 잎 디스크를 수화하는 것입니다. 잎 디스크는 실온에서 24 시간 동안 떠있게 할 수 있습니다.
    5. 플레이트에서 이제 완전히 수화 잎 디스크를 제거하고 부드럽게 디스크를 계량하기 전에 종이 타월로 잎 디스크의 외부를 건조. RWC 계산을위한 과장된 무게 (TW) 이러한 가중치를 기록합니다.
    6. 종이 실험실에 배치 잎 디스크는 24 시간 동안 55 ° C에서 인큐베이터에서 닦아 또는 페트리 접시에 여과지 디스크 및 건조.
      참고 : 용지가 건조하는 동안 배양 접시에 부착 잎 디스크를 방지 할 수 있습니다.
    7. 마른 잎 디스크와 RWC 계산을위한 기록 건조 무게 (DW)를 달아.
    8. 스마트 빙햄 (11, 12)에 의해 설명 된 RWC는 Weatherley의 공식을 사용하여 계산합니다.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW 신선한 무게, TW = 과장된 무게, DW는 = 건조 중량을 =
    9. 시험의 각 생식과 치료 단계를 반복 4.1.
  2. 기록 식물 윌 가뭄 스트레스 시험의 1 일 및 식물의 100 %가 일반적으로 하루 4, 5, 시들 때 종료에 회 시작입니다.
  3. 복구 단계 및 성장 차동
    1. 하루 6 일, 가뭄 스트레스 기간을 체결하고 스트레스 식물은 재판의 회복 단계를 입력합니다. 제어 트레이로, 2.1 단계, 물 아래 트레이를 입력하고 가뭄 스트레스 트레이 표준 물 일정을 다시 시작하기 전에 24 시간 동안 흡수 할 수 있습니다.
    2. 모든 식물 10 일 동안 복구 할 수 있습니다.
    3. 십일에서 포스트 가뭄 스트레스 각 식물의 지상 부분 위의 전체를 수확하고 신선한 무게를 기록한다.

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결과

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이 프로토콜 가뭄 스트레스 반응의 경우에, 원하는 실험 형질하여 모집단을 분리하기 위해 대형 스크린을 수행 할 때, 대응 매우까지 변화한다 생성 데이터 가능성 가뭄 내성 사이의 모든 지점에 민감 강조한다. 그림 1은이 프로토콜에서 예상 할 수있는 결과의 유형을 나타내는 그래프가 포함되어 있습니다. 세 가지 다른 양상추 유형 (로메인 (COS), crisphead 및 Butterhead 상)의 대표 품종​​은 표시된 데이터에 포함되어 있습니다. 만 세 상추 유형을 나타내는 데이터가 여기에 표시되어 있지만이 프로토콜은 대부분의 유형에서 양상추와 시금치 생식의 수천의 심사 중에 개발되었습니다. 상추의 세 가지 유형 외에도 이전에이 프로토콜이 성공적으로 제작 관련이없는 것으로도 밀접한 관련이 왕 고들빼기 속 serriola 종에서 생식과 함께 유형 양상추 빨간색과 녹색 잎을 화면과 줄기를 사용 하였다 언급afy 녹색 야채 시금치. 저자는 현장 시험 200 상추 품종의 후보 풀에 4,000...

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토론

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화면 샘플 수의 고려 사항.

필요한 샘플의 수는이 화면에서 희망 데이터에 기초하여 이용되어야한다. 공개 품질 결과가 요구되는 경우에는 각 행에서 세 개별 식물 (3 생물학적 복제물)을 수확 및 품질 통계 분석에 적절한 포인트를주고 2 회 반복 실험의 최소값을 수행하도록 권장한다. 원하는 결과 인 경우 단순히 빨리 더 엄격한 복잡한 물 스트레스 실험, 적은 샘플을 수행하기 위해 후보 유전자 원의 큰 수영장을 축소하고 또는 반복 실험이 필요할 수 있습니다. 필요한 샘플 수는 파종시에 결정되어야한다.

심기 레이아웃과 트레이 토양 건조의 고려 사항.

하나의 매우 중요한 고려 사항은 플러그 트레이의 가장자리에 세포에서 토양이 내부 세포 및 관리에보다 더 빠르게 건조 것입니다만 트레이 내부 (그림 2)에서

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 이 프로토콜의 개발로 이어진 프로젝트에 자금을 지원해 준 캘리포니아 식품 농업부에 감사를 표합니다. CDFA SCB11019.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플러그 트레이 128T.O. Plastics
Hummert International		11-8595-1모든 브랜드의 플러그 트레이가 작동하지만 모든 시험에 동일한 스타일의 트레이를 사용합니다.
하단 트레이 (디스플레이 트레이)T.O. Plastics
Hummert International		11-3305-1
플러그/식물 믹스 (Sunshine Mix #5)Sunshine
Hummert International		10-0467-1이 프로토콜을 다른 작물에 적용하는 경우 다른 믹스로 교체해야 할 수도 있습니다.  선샤인 믹스 #4는 시금치 시험에 사용되었습니다.
비료 (20-20-20)Jack's: Professional 수용성 비료
Hummert International		07-5915-1모든 비료를 사용할 수 있으며, 특정 작물 요구에 맞게 이 프로토콜을 조정하기 위해 필요에 따라 유형을 조정하십시오.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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