리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

요약

리스테리아 단세포 유전자는 취약한 인구에 있는 임산부및 뇌막염에 있는 태아 감염을 일으키는 원인이 됩니다. 박테리아의 하위 인구는 심장 조직을 식민지화 할 수 있습니다, 환자와 실험실 동물에 심근염을 일으키는. 여기에서 우리는 감염된 동물에 있는 체외 및 심장 식민지에 있는 L. monocytogenes 심장 세포 침략을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

리스테리아 단세포 유전자는 면역 손상 환자, 노인 및 임산부에서 심각한 침습적 감염을 일으킬 수있는 그램 양성 성 세포 내 병원균입니다. 인간에 있는 listeriosis의 일반적인 표현은 뇌막염, 뇌염 및 태아 낙태를 포함합니다. 침략적인 L. monocytogenes 감염의 중요하지만 훨씬 적게 문서화된 속편은 심혼을 관련시킵니다. 심장 병에서 죽음 비율은 처리에도 불구하고 최대 35%까지 일 수 있습니다, 그러나 아주 거의 심장 조직 및 그것의 결과병학의 L. monocytogenes 식민지에 관하여 알려져 있습니다. 또한, 최근 L. 단세포 유전자의 하위 인구가 심장 조직 내에서 침입하고 성장할 수 있는 향상된 용량을 가지고 있다는 것이 명백해졌습니다. 이 프로토콜은 L. monocytogenes 분리의 심폐소생학을 평가하는 데 사용할 수있는 생체 외 및 생체 내 방법에 대해 자세히 설명합니다. 방법은 H9c2 쥐 심장 근막의 감염뿐만 아니라 감염된 마우스의 심장의 세균 식민지의 결정에 대해 제시된다. 이러한 방법은 감염된 동물의 심장 조직을 식민지화 할 수있는 잠재력을 가진 균주를 식별하는 데 유용할뿐만 아니라 심장 세포 침입및 / 또는 심장 병리학의 변화를 촉진하는 역할을하는 세균 성 유전자 제품의 식별을 용이하게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 다중 L. monocytogenes 균주 사이 심혈 성 부속의 직접적인 비교를 제공.

서론

리스테리아 단세포 유전자는 노인, 임산부, HIV/AIDS를 가진 사람들 및 화학요법을 받는 사람을 포함하여 취약한 인구에 있는 가혹한 질병을 일으키는 원인이 될 수 있는 그람 양성 세포내^{병원체입니다 1.} 이 인구에 있는 감염은 수시로 오염한 식품을 섭취의 결과이고, 대부분의 감염은 대규모 식품 매개 발발과 연관됩니다^2,3. 인간과 다른 포유동물에서, L. monocytogenes는 소장의 상피 경계를 가로질러 배설할 수 있고, 그 후에 간^4,5로이송된다. 동물 모델은 섭취한 박테리아가 장 내의 담악과 포털 정맥을 통해 간으로 이동하거나 혈류로 막대한 림프절을 통해 퍼지며 간 및 비장에 혈액 선서를 통해 혈액 류로 확산되는 것을 제안한다^6,7. 간과 비장에서 박테리아는 전문 식세포뿐만 아니라 상주 한창 세포로 섭취를 중재 할 수 있으며 이러한 장기 내에서 신속하게 감염을 확립합니다. 세균성 하중이 증가함에 따라, 수많은 박테리아는 혈액으로 다시 분산되어 중추 신경계와 태반 (현재)을 포함하여 취약한 조직을 더 식민지화 할 수 있습니다. 이 사이트의 식민지는 뇌막염, 뇌염 및 태아 낙태^2를포함하여 인간에서 리스테리오증의 일반적인 표현을 배제합니다.

프로토콜

1. L. 단세포 유전자 균주에 대한 저장 및 문화 조건

1. 뇌 심장 주입 한천 (BHI)을 자동화하고 용융 된 미디어를 페트리 플레이트에 부어 고체 미디어를 준비하십시오. 플레이트가 실온에서 하룻밤 동안 건조한 다음 다시 37°C에서 하룻밤을 건조시도록 합니다.
2. 멸균 루프를 사용하여 이전에 만든 냉동고 주식(BHI 액체 미디어에서 20% 글리세롤에 매달린 박테리아, -80°C에 저장됨) 또는 이전에 는 콜로니를 함유한 한천판으로부터 L. 단세포유전자의 작은 샘플을 획득하여 이전에 는 격리를 위해 강타하였다.
3. 무균 기술을 사용하여 단일 콜로니 격리를 위해 샘플을 줄입니다. 초과 이월을 방지하고 평가되는 균주의 개별 식민지의 격리를 보장하기 위해 크로스 줄무늬 사이의 루프를 소독해야합니다. 플레이트(들)를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
4. 멸균 루프를 사용하여 14ml 폴리스티렌 튜브에서 분리및 2 ml의 BHI 국물(agar 제외)의 콜로니를 제거합니다.
5. 해석 및 감염의 경우, 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 국물 배양을 정전기(흔들림 없이)로 배양한다. 배양 된 분리물의 스타킹을 위해, 하룻밤 180-200 rpm에서 흔들어 37 °C에서 국물 문화를 배양. 배양은 ....

결과

L. monocytogenes의 선택된 분리는 세포 배양및 감염의 마우스 모형에서 심장 세포의 강화한 침략을 전시합니다. 도 1은 한천 매체에서 현탁액의 현탁액을 반점 도금 한 다음 세균성 식민지가 어떻게 나타날 수 있는지를 보여주는 예입니다. 이 방법을 사용하면 많은 수의 천 미디어 플레이트를 사용하지 않고 샘플 내에서 CFO를 정확하게 평가할 수 있습니다. 도 2는 긴장07PF0776의 심장 세포를 침범하는 균주 10403S의 능력을 비교하는 조직 배양 기반 분석의 예를 나타낸다. 10403S에 감염된 세포에 비해 젠타미신 치료에 따른 감염된 H9c2 심장 세포로부터 2배 이상 많은 07PF0776세균CFU를 회수할 수 있다. 2 ~ 4 배의 차이는 이 분석기를 사용하여 심장 tropic 긴장에 대해 일상적으로 관찰됩니다. 도 3은 감염 후 3일 동안 간, 비장 및 감염된 마우스의 심장으로부터 박테리아가 회복된 예를 나.......

토론

L. 단세포 유전자는 광범위하고 잘 특징인 인간 병원체, 다른 질병 표현의 다수를 일으키는 원인이 될 수 있는^15. 박테리아는 이전에 중앙 신경계에 도달하고 식민지화하고 태아를 개발하기 위하여 혈액 두뇌 장벽 및 태반 태아 장벽과 같은 장벽을 가로질러 배분하는 기능에 대해 설명되었습니다. 이 조직을 식민지화하는 유기체의 생체 내 능력은 종종 표적 장기를 구성하는 배양에서 대표 세포를 침입하는 체외 능력에 의해 보완됩니다. 예를 들어, 코로이드 신경총에서 상피 세포의 침입은 CNS^16을식민지화하는 유기체의 능력과 연관되어 있다; 그리고 사악한 열대 성소 이출은 모계 태아 장벽^(17)을나타내는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 방법은 간 및 비장의 식민지화에 비해 개별 격리에 대한 심장의 세균 성 식민지화의 비교뿐만 아니라 배양에서 심장 세포의 세균 적 침입을 평가하는 데 유용하다고 설명되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Difco	BHI 육수 베이스	237200	뇌 심장 주입 분말 2kg(한천 제외)
Difco	한천	214510	과립 한천 2kg
Difco	BHI 한천	241810	7.5% 한천 함유 뇌 심장 주입 분말 2kg
	LB 육수 베이스	12975-084	루리아 육수 베이스 분말 2kg(한천 제외)
피셔	글라스 커버슬립	12-545-80	12mm 유리 커버슬립
Falcon	24웰 조직 배양 플레이트	35-3047	24웰, 플라즈마 처리 조직 배양 플레이트
Falcon	14mL 폴리스티렌 튜브	352051	14ml 폴리스티렌 튜브
Falcon	96웰 U-바닥 플레이트	35-3077	비조직 배양 처리된 96웰 플레이트
Corning	0.05% 트립신, 0.53mM EDTA(1X)	25-052-CI	조직 배양을 위한 트립신 EDTA 원액
Corning	DMEM(High glucose, High Pyruvate)	15-013-CU	FBS, 글루타민 또는 항생제가 없는 DMEM 배지
Corning	Pen/Strep/Glut 용액	30-009-CI	조직 배양을 위한 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민의 원액
혼합물 Corning	Gentamicin	30-005-CR	조직 배양을 위한 겐타마이신 50mg/ml 스톡 용액
Cellgro(Corning)	L-글루타민	25005197	항생제가 없는 스톡 L-글루타민 솔루션
Denville	75cm^2 플라스크	T1225	75 cm2 조직 배양 처리 플라스크
Denville	1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	2013004	1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브
ATCC	H9c2 심장 근아세포	CRL-1446	쥐 심장 근아세포
Hyclone	소 태아 혈청	SH30070.63	소 태아 혈청