자동화 된 이미지 처리 방식을 사용하여 마우스 사교성의 실험 평가

장애인 사교성은 자폐증 스펙트럼 장애 (의 ASD) ^{1, 2를} 포함하는 신경 발달 장애의 범위의 기본 증상 도메인 중 하나입니다. 그것은 심각한 관계를 개발하는 환자의 능력을 제한하고 크게 환자, 가족, 보호자 ^{2,3 영향을} 미칩니다.

더 나은 치료를 손상 사교성 기초가되는 메커니즘을 이해하고 개발하기위한 노력의 일환으로 여러 마우스 모델 ^1,4-9을 연구 하였다. 그러한 변형은 BALB / C 마우스, ASD5 ^8-12 환자에서 본 기능을 닮은, 현저하게 낮은 사교성을 나타내는 타고난 변형이다. 예를 들어, BALB / C 마우스는 사회적 접근과 스위스 웹스터 비교 균주 ^(10)보다 자극 마우스 (예를 들어, 사회 회피)에 의한 사회적 접근에 일반적으로 부정적인 응답의 낮은 주파수를 표시합니다.

제안 된 치료가 effectiv 있는지 여부를 테스트하려면사교성을 높이는 전자는 객관적 조치가 필요하다. 널리 받아 워크 세 구획되어있는 표준 장치에서 사교성를 분석하는 것이다 (도 1 참조).

왼쪽과 오른쪽 구획 각각은 사회적으로 두드러진 자극 마우스를 수용 반전 와이어 컵이 포함되어 있습니다. 시험 마우스 세에서 10 분 간격으로 (세션 I-III)하기위한 장치로 방출된다 세션 II 및 III 시험 마우스의 사교성의 다양한 측면을 평가하는 동안 세션 나는 시험 마우스의 운동 활성을 평가합니다.

세션 I에서, 시험 마우스 장치에 적응시킨다. 이 세션에서, 시험 마우스가 다른 구획 사이하게 전이의 수를 측정한다. 중요한 것은, 사교성 측정은 표준 3 구획에있어서 운동 활성에 의존 얻어진 감소 된 운동 활성의 SOCi 해석을 혼동 할능력 데이터.

세션 II, 시험 마우스 자유롭게 이동하고 자극 마우스 반전 컵 중 하나에 배치된다 (카운터). 자극 마우스는 4 주령 이계 수컷 ICR 마우스, 나이와 성별 일치 테스트 마우스에 있습니다. 자극 마우스는 사회 구획으로 지정 측면에서 거꾸로 컵에 동봉하고, 빈 반전 컵은 nonsocial 구획으로 지정 측면에 배치됩니다. 세션 II, 시험 마우스의 사교성은 (는) (이하 2cm 거리)는 "nonsocial"거꾸로 컵 근처에 소비 한 시간 대 "사회"거꾸로 컵 근처에 소비 한 시간을 비교하여 정량화하고, 시간을 기준으로한다 그것은이 nonsocial 실에서 소비 한 시간 대 사회 구획에 보낸다. 스위스 웹스터 마우스 비교기 사회적 구획 및 사회에 대한 유의적인 환경을 보여주지 BALB / c 마우스에 비해 사회적 반전 컵 근방 훨씬 많은 시간을 소비거꾸로 컵 또는 사회적 실 ^(12).

세션 III에서, 테스트 및 자극 마우스 (반전 컵이 제거) 자유롭게 상호 작용할 수 있습니다. 구획 사이의 사교성의 조치에 박힌 행동과 전환을 안정적으로 테스트 및 자극 마우스와 분석 간의 자유로운 상호 작용의 세 번째 10 분 세션에서 얻을 수있다. 이 보고서에서 테스트 마우스의 사교성은이 조치를 통해 정량화 : 그것은 사회적 접근이 자극 마우스를 향해 (코 첫번째) 전진으로 정의 자극 마우스,으로 만드는 사회적 접근 방법 1) 수를되도록 코는보다 2cm 떨어진 자극 마우스에서이다; 2) 자극 마우스에 의한 사회적 접근의 avoidances의 수. 이 켜거나 자극 마우스에서 멀리 이동하거나 일시적으로 자극 마우스 후 ( "행동을 동결") 이동 중지 된 경우 테스트 마우스를 접근 한 경우 테스트 마우스는 접근 방식을 피하는 것으로 간주됩니다. BALB /c 마우스 스위스 웹스터 비교기 ¹⁰ 균주에 비해 자극 마우스 자극 마우스에 의한 사회 접근법 부정적인 응답의 수가 증가 향해 이루어지는 사회적 접근법의 수의 감소를 나타낸다.

행동 영화의 평가는 전통적으로 (아마도 감소 속도) 신중 영화를보고 마우스 특정 구획 또는 반전 된 컵 ^(10)의 하나의 근처에 소비하는 시간을 스톱워치를 활성화함으로써, 즉 수동으로 수행되었다. 이 방법은 따라서 반복 동영상의 시청 요구이며, 아주 시간 소모적. 또한, 정밀도가 마우스 반전 컵 2cm 내에 있는지 여부를 인식하는 스톱워치 및 측정 능력 평가자의 반응 시간에 의해 제한된다. 최근 작업이 화합물에서 (D 세린과 D-시클로 세린)가 BALB / c 마우스 ^9,10,12에 사교성을 복원하는 효과가 입증되었다. 그것은 두 구성 요소의 MODU 것으로 알려져있다늦은 공지 된 NMDA 수용체는 사회적 행동 ^2,12에서 중심적인 역할을한다. 화합물의 대규모 어레이는 잘 정의 된 다양한 방식으로 NMDA 수용체 활성을 조절하는 것으로 알려진 한 ASD 처리의 침투의 잠재력이 화합물 우선 매우 바람직한 평가를위한 빠른 자동있어서의 신속한 평가를하게된다.

아래에서 설명하는 마우스 사교성의 평가를 위해 개발 한 자동 분석 절차입니다. 이는 마우스 나 마우스의 위치를​​ 식별하는 마우스 영화의 모든 프레임의 화상 처리 방법을 사용한다. I 및 II 세션에서, 상기 코 위치를 검출하고 사교성 측정을 계산하는 데 사용한다. 세션 III에서는 자동으로 모든 접근을 감지하지만, 수동 분류 (사회적 접근, 사회적 회피, 또는 기타)가 필요합니다.

1) 실험 과정과 2) 자동 분석 : 설명의 편의를 위해 프로토콜은 두 부분으로 나누어 져있다. 모든 동물은 실험 동물 ^(15)의 관리 및 이용에 대한 안내에 따라 처리하고, 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 실험 절차

1. nonsocial 사회, 중성 중간 구획 (그림 1) : 검은 비 반사 유리 야 직사각형 상자 세 구획으로 나누어 (52 × 25 X 23cm ^3)이다 케이지를 설정합니다. 세션에서 최종 구획의 각 반전 와이어 컵을 놓고 I (아래 설명) II 및 세션 II 동안 자극 마우스를 수용.
2. 케이지는 시야를 채우는 방식으로 카메라를 설정합니다. 조명이 마우스의 동작을 방해 할 수 있기 때문에,에서 간접 광에서 오는 케이지 안에 이하 3.5 룩스의 휘도를 유지백열 전구 및 상향 방향의 카 바닥에 측정 하였다. 또한 감지 할 수 있지만, 카메라를 검출 할 수있는 쥐 적외선 광원을 사용한다. 720 × 480 표준 해상도의 모든 동영상을 기록합니다.
3. (이하 "기준 프레임"이라고합니다) 나중에 이미지 처리를위한 빈 케이지의 단일 프레임을 기록하고 그레이 스케일 이미지로 저장합니다.
4. 세션 I은 : 새장에 테스트 마우스를 소개하고 세션의 시작 (자동 분석 비교) 나타내는 케이지 위에 손을 흔들어. 10 분 동안 기록 영화. 10 분의 끝에서, 원래의 케이지에 다시 넣어 마우스.
5. 세션 II는 : 반전 컵 중 하나에 자극 마우스를 착용 할 것 (카운터).
6. 자극 마우스 왼쪽 또는 오른쪽에 반전 컵에 반전 컵에 있는지 여부를 선택하기 위해 "사회 왼쪽"또는 "사회적 권리"버튼을 사용합니다.
   참고 : 자극 마우스로 반전 컵은 다른 반면은 "사회 컵"라고합니다컵 "nonsocial 컵". 있는 사회 컵 사회적 구획라고하는 구획의 nonsocial 한잔과 함께 함은 nonsocial 구획하고, 중간 칸은 "중립 함"입니다.
7. 새장에 테스트 마우스를 소개합니다. 케이지 위에 웨이브 손 세션의 시작을 표​​시한다. 10 분 동안 기록 영화. 중요한 것은, 세션 III를 시작 반전 컵을 제거하기 전에 사교성 장치에서 쥐를 유지합니다.
8. 세션 III :, 반전 컵을 제거 모두 쥐를 해제하고 테스트 및 자극 쥐가 서로 자유롭게 상호 작용할 수 있습니다. 케이지 위에 웨이브 손 세션의 시작을 표​​시한다. 10 분 동안 기록 영화. 10 분의 끝에서 다시 각 케이지 모두에 마우스를 넣어.

2. 자동 분석

주 : (2)의 명령은 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 발행되는 콘 (도 2 참조)우리의 소프트웨어를 trols. 여기에서 우리는 우리의 소프트웨어가 있습니다 단계별 처리를 설명; 또한이 소프트웨어는 사용자 입력없이 배치 모드에서 분석을 수행 할 수있다.

1. 모든 영화의 경우, 다음의 처리 단계를 실행 :
   1. 로드 무비 (Load 버튼을 클릭).
   2. 분석 프로그램을 케이지 경계 구획 경계 위치와 컵의 위치를​​ 알려주 케이지 구성을 선택한다. 네 저장된 구성 중 하나를 선택하거나 수동으로 모든 좌표를 조정합니다.
      참고 : 구성은 일반적으로 한 실험에서 다음에 변경되지 않으므로 재사용 할 수 있습니다.
   3. 동영상의 각 프레임에 대해, 다음의 처리 단계 (2.1.3.1-2.1.3.6)을 수행한다.
      1. 은 "그레이 스케일"버튼을 클릭하여 그레이 스케일로 프레임을 변환합니다.
      2. 디지털 "빼기"버튼을 클릭하여 그레이 스케일의 참조 프레임을 (단계 1.3 참조) 뺍니다. 주 :이 단계의 목적은 화소 VA 만드는 것이다매우 가까운 프레임의 역병은 마우스의 위치를​​ 제외하고 모든 곳에서 제로입니다.
      3. 블랙에 특정 임계 값 레벨 아래의 모든 픽셀을 설정하여 프레임을 이진화, 흰색에 그 수준 위의 모든 픽셀 (이하 "이진화"버튼을 클릭).
         주 : 아이디어는 마우스의 화소는 일반적으로 나머지 픽셀보다 더 높은 값을 가질 수 있기 때문에, 마우스 화소가 흰색과 다른 모든 픽셀 검정 될 것이라는 것이다. 최적 임계치 레벨은 조명 조건에 의존하고, 영화에 걸쳐 마우스 형상을 평가함으로써 결정될 수있다. 임계 값이 너무 낮게 선택되면, 마우스가 너무 크게 나타나고, 마우스에 속하지 않는 화소가 백색 착색 될 수있다. 임계 값이 너무 높은 경우, 마우스가 작아 져 끊어 조각으로 분해 할 수있다. 기록 영화에서 최적의 임계 값은 20과 35 사이 (0 ~ 255 규모에) 항상 있었다.
      4. ERO 진수 화 사진 전자 번, 그 다음 다음 ¹³ 2E 번 팽창 ⁽¹³⁾ 침식드 다시 전자 번 버튼 "EROD / DIL을"밀어.
         참고 :이 절차 목적은 꼬리를 제거하는 것입니다. 사용 된 해상도 (× 480 720), 대한 전자 = 3은 모든 상황에서 일했다.
         주 : 소프트웨어가 사진의 손의 존재를 자동으로 검사 (영화 등의 기록시 손이 세션의 시작을 표​​시하는 화상을 흔들며된다). 손이 있으면 손을 마우스에 비해 훨씬 크기 때문에, 이진화 된 프레임에서 비정상적으로 많은 흰색 픽셀이있을 것이다. 손의 존재를 조건은 치화 프레임 10,000 이상의 백 화소가 있다고한다. 소프트웨어는 I, II 및 III, 손 움직임이 발생하는 프레임의 범위를 검출하여 세션의 시작을 결정한다.
2. 다음과 같은 세션에서 I과 II, 계속 :
   1. 흰색 픽셀 세트의 가장 큰 연결된 구성 요소를 감지 ( "LComp"를 클릭). 참고 : 목적 O를(F)이 단계는 마우스, 예를 들어, 세션 II의 자극 마우스의 움직임에 의해 야기 속하지 않는 흰색 픽셀을 제거한다. 가장 큰 연결된 구성 요소는 거의 모든 프레임 마우스입니다.
   2. "엔드 찾기"를 클릭하여 (마우스의 "끝"이라고 함)이 가장 먼 흰색 픽셀을 결정합니다.
      주 : 소프트웨어가 첫 번째 프레임에 양단 각각에 대해, 즉 양단의 연속성을 확립 그들이 속한 후속 프레임의 단부의 어느 것이다. 일반적인 생각은 프레임이 고속으로 기록되므로, 단부는 한 프레임에서 다음 프레임까지 이동할 수없는, 그래서 그 다음에 하나의 프레임의 단부의 정확한 지속에 대한 거리의 합을 최소화하는 것을하다 끝은 이동합니다. 자세한 세부 사항에 대한 설명을 참조하십시오.
   3. 코입니다 마우스하는 쪽을 결정합니다.
      1. 방향을 결정하는 관찰하여 마우스 이동 방법 무게 중심 (COG)프레임으로부터 변경 (톱니 바퀴의 움직임이 마우스의 모든 화소들의 합 모션이다) 프레임한다.
         주 : 화소 P _(1)의 일련의 COG는, ..., 좌표 값 (P) _{n을 1,} ..., _{Xn에은으로} 정의되고, X :
         
         마우스는 일반적으로 (자신의 코를 향해, 즉) 앞으로 이동합니다. 수백 프레임의 섹션에서 헤드 / 테일 검출에 매우 높은 신뢰성은 항상있다.
         참고 : 소프트웨어가 자동으로 감지 어떤 방향으로 마우스가 이동 종료 결정한다 이를 코로 확인하고 영화에 빨간색 원으로 표시됩니다. 검출 노즈 프레임마다 적색 동그라미로 표시 될 때, 사용자가 검색의 품질을 검사 할 수있다.
3. 다음과 같이 세션 III에서, 계속 :
   1. 흰색 픽셀이 가장 큰 구성 요소를 감지합니다.
      1. 모두 오전 허용 크기 인 경우여러개 중력 그 중심 (톱니)은 이전 프레임의 마우스 톱니이 두 구성 요소를 두 마우스 고려와 호환된다.
      2. 이 거리는 다음 (그들이 이전 프레임 이후 20 % 이상 변화하지 않은 경우, 마우스는 허용 가능한 크기를 고려하고, 그 차이가 마우스 프레임 사이의 시간에 이동할 수있는 거리보다 크면 호환 같이 연속하는 2 프레임의 톱니 고려 여러 개별 마우스의 움직임을 분석함으로써 실험 시리즈의 제제의 일부로서 결정될 수있는 최대 마우스 속도에서 (I 및 II 세션에서와 같이).
         주 :이 큰 구성 요소가 마우스 허용되지 않는 크기, 또는 톱니가 이전 프레임의 것과도 다른 경우, 가장 큰 두 성분으로 허용 크기까지 소프트웨어가 자동 치화 임계 값을 증가시키고, 그 톱니와 호환 이전 프레임들.
   2. 에서 테스트 마우스를 클릭첫번째 프레임. 세션 III의 모든 프레임 테스트 및 자극 마우스 모두를 식별하기 위해 2.3.1의 분석을 사용합니다.
   3. 하나의 마우스가 사회적으로 다른 접근하는 세션 III에서 프레임을 확인합니다. 주 : 소프트웨어가 자동으로 마우스 사이의 거리가 마우스의 전형적인 상호 작용 거리보다 작다는 것을 확인하여이 단계를 구현 (우리는 2cm 사용).
   4. 소프트웨어가 사용자 검출 방법과 동영상의 짧은 세그먼트를 재생하는 경우,이 방법은 시험 마우스 또는 어느 것에 의해서도 시험 마우스 사회적 회피하여 사회적 접근 자격 여부를 지시하는 버튼을 클릭한다.
      참고 :이 테스트 마우스 인 마우스 알려진 경우 단계 2.3.4은이 자동화 할 수 있습니다. 이 정보는 마우스는 서로 너무 가까워 질 때 손실 (또는 서로의 위에 올라) 및 우리가 이후 아직 우리의 소프트웨어에 의해 확실하게 검출 수행 할 수있는 방식으로 마우스를 라벨 할 수있는 방법을 발견하지 얻는다 때문에 자신의 행동에 영향을 미치지, 우리는에 복귀했다지금은 수동 분류.
4. 로드 버튼을 사용하여 처리 영화,로드 무비를 알아보고자 하였다.
   1. 세션 1의 첫 번째 프레임을 표시 세션 시작 1을 클릭 (또는 세션 2의 첫 번째 프레임을 표시 세션 2를 시작합니다).
   2. 동영상을 재생 및 중지 재생 / 정지를 클릭합니다.
      참고 : 처리 된 영화는 다르게 색 원으로 표시 머리와 꼬리와 마우스를 표시합니다. 모든 사교성 조치가 화면에 표시되고 동영상이 재생으로 업데이트됩니다.
   3. "내보내기"를 클릭하여 Excel 형식으로 내보내기 사교성 데이터.
   4. 하나의 엑셀 파일로 폴더에있는 모든 영화의 모든 데이터를 컴파일 "컴파일 데이터"를 클릭합니다.

그림 3은 빈 케이지와 행동 영화의 컬러 프레임을 보여줍니다. 마우스는 아직 케이지에 도입되지 않았습니다. (사회적 nonsocial) 컵 및 구획 경계의 위치는 중첩된다. 도 4에 도시 된 참조 프레임으로 사용 된 비어있는 케이지의 색 프레임은 8 비트 그레이 스케일로 변환된다. 기준 프레임은 캡쳐 된 동영상의 모든 다른 프레임으로부터 감산된다.

그림 5는 중첩 구획 경계와 컵의 위치를 다시, 세션 I 동안 영화에서 프레임 중 하나를 보여줍니다. 참조 프레임을 차분 프레임이라고 샘플 프레임 결과로부터 감산되어,도 6에 도시된다.

도 7은 상기 차분 프레임의 진화 버전이다. (섹션 2.1.3.3 참조). 그림은 또한 코 (빨간색 원)의 위치와 TA의 기본을 보여줍니다김정일 (회색 원)) 섹션 2.2.4에서 결정.

노즈 위치 동영상의 각 프레임에 대해 확립되면, 마우스의 궤적은도 8. 임의의 방식으로 분석 약 1,000 프레임 커버 영화의 부분을 마우스 코의 위치 (백색 원)를 표시 할 수있다 (~ 30 초).

도 9는 케이지 구획 간의 천이의 수는 운동 활성의 척도로서 사용된다 세션 I.위한 사교성 분석의 결과 (도시 된 예에서, 10 분, 59 전환 정상적인 운동 활성을 나타낸다)을 나타낸다. 케이지의 다른 부분에 소요 된 시간은 세션 II의 사회적 부 / 컵에 대한 선호도를 판단하는 기준 역할을한다.

도 10은 세션 II위한 사교성 분석의 결과를 나타낸다. 특히 관심의 표시 엑사으로합니다 (nonsocial 대 사회 컵 근처에 소요 된 시간이다mple 230.8 대 72.3 초)과 중립 및 nonsocial 구획 (314.7 대 109.4 대 185.5 초) 대 사회. 사회 컵과 구획으로 맑은 바이어스 제어 마우스에 대한 전형적인 및 세션 I (그림 9)의 데이터와 비교하여 명확하게 바이어스 정말 자극 마우스의 존재의 결과임을 보여줍니다.

도 11은 세션 III위한 사교성 분석의 결과를 나타낸다. 사회적 접근 (35 분 10)뿐만 아니라 자극 마우스 (9/10)에 의한 사회적 접근에 압도적으로 긍정적 인 반응의 높은 수는 정상 사교성와 마우스의 전형이다.

그림 2. 그래픽 사용자 인터페이스입니다. 하시기 바랍니다 다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 핥아.

도 3 빈 케이지. 이것은 그레이 스케일 변환 후의 기준 프레임으로서 사용된다. 빨간색 원은 반대 측의 사회 컵과 nonsocial 컵의 위치를​​ 보여줍니다. 수직 흰색 선은 다른 구획에 케이지를 분할하고, 사각형은 케이지의 내부 경계를 보여줍니다.

그림 4. 그림 3의 그레이 스케일 버전.

5. 원래 프레임 그림. 그레이 스케일 형식의 동영상 프레임. 사회 실린더는 흰색 원으로 표시되며,사회 실린더보다 2cm 더 큰 반경 추가 회색 원은 시험 마우스가 사회 실린더에 "가까이"로 간주되는 영역을 구별하기 위해 그려집니다. 반대 구석에서, nonsocial 실린더는 다시 회색 원과 큰 반경 가까운 nonsocial 실린더로 간주되는 영역의 경계에 그려지는 2cm에 추가 원으로 표시됩니다. 수직 흰색 선은 다른 구획에 케이지를 분할하고, 사각형은 케이지의 내부 경계를 보여줍니다.

6. 차이 이미지를 그림. 이미지는 샘플 프레임과 기준 프레임을 뺀.

그림 7. 진화 된 이미지입니다. 디의 픽셀(예 30) 특정 임계치를 초과 fference 화상 마우스 픽셀을 고려 화이트 나타낸다. 빨간색 원은 코를 나타내고, 흰색 원은 꼬리입니다.

그림 8. 마우스 궤적. 작은 흰색 원이 프레임이 캡처 된 I 때까지 세션의 시작부터 코의 위치를 보여줍니다.

세션 I.에 대한 사교성 분석 그림 9. 결과는 각각의 케이지 구획 위의 숫자는 시간을 나타냅니다 (이 경우 그들에 소요 마우스 왼쪽 칸에서 254.3 초, 중성 실에서 155.2 초, 오른쪽에서 237.0 초 구획). 동그라미 안의 숫자는 시간 마우스가 입술에 가까운 소비 나타낸다pective 컵 ( "가까운"멀리보다 2cm를 의미, 또는 두 개의 원의 외부 내부) : 가까운 왼쪽 컵에 140.0 초, 닫을 오른쪽 컵 105.6 초. 하단 중앙의 숫자는 마우스가 케이지의 다른 구획 (예 59 회) 사이에 전환 빈도를 나타냅니다.

세션 II에 대한 사교성 분석 그림 10. 결과. 세션 II에, 하나의 자극 마우스 구획 위 원은 그림 9 / 세션 I. 주와 같이 케이지의 다른 부분에 소요 된 시간을 나타냅니다 내부의 번호가 있음 반전 컵 (이 경우 왼쪽 하나)의, 그래서이 잔은 "사회"컵이된다. 처음가 주어진 세션에 대해 I의 대책뿐만 아니라, 시간 시험 마우스 사회적 실린더 (2cm 이내) 가까이에 걸리는중앙의 오른쪽 아래에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세션 III에 대한 사교성 분석 그림 11. 결과. "접근"다음의 숫자는 테스트 마우스에 의해 만들어진 사회적 접근, 순위 "후 숫자의 수를 말한다. RESP. "와"NEG. RESP. "상태 자극 마우스에 의한 사회적 접근에 테스트 마우스로 긍정적이고 부정적인 응답 수.

저자는 공개 아무것도 없어.