형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

요약

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

초록

일체형 막 단백질의 올바른 토폴로지와 방향은 적절한 기능을 위해 필수적이지만, 많은 막 단백질에 대해 이러한 정보가 확립되지 않았습니다. 형광 프로테아제 보호(FPP)라는 간단한 기술이 제시되어 살아있는 세포의 막 단백질 토폴로지를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 막 단백질의 다양한 도메인에 대해 여러 항체를 사용할 필요가 없고, 많은 양의 단백질을 필요로 하지 않으며, 살아있는 세포에서 수행할 수 있다는 점에서 단백질 토폴로지를 결정하는 다른 방법에 비해 많은 이점이 있습니다. FPP 방법은 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 지정된 막 단백질의 분해에 대한 프로테아제의 공간적으로 제한된 작용을 사용하여 막 토폴로지 및 방향을 결정합니다. 이 간단한 접근법은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있으며, 미토콘드리아, 골기(Golgi), 소포체(endoplasmic reticulum) 및 엔도솜/재활용 시스템의 구성 요소와 같은 다양한 세포 내 소기관에서 막 단백질 배향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 융합체로 N-말단 또는 C-말단에 태그된 막 단백질은 관심 세포에서 발현되며, 이는 세제 디지토닌을 사용하여 선택적 투과화의 대상이 됩니다. 디지토닌은 세포 내 소기관을 그대로 유지하면서 원형질막을 투과화하는 능력이 있습니다. 세포질에 노출된 GFP 부분은 프로테아제의 적용을 통해 선택적으로 분해될 수 있는 반면, 소기관의 내강에 존재하는 GFP 부분은 프로테아제로부터 보호되고 손상되지 않은 상태로 유지됩니다. FPP 분석은 간단하며 결과를 빠르게 얻을 수 있습니다.

서론

세포막뿐 아니라 수많은 세포 막은, 수성 두 구획을 분리 장벽의 역할을한다. 세포막의 경우, 분리와 외부 셀의 안쪽이고; 세포 내 소기관 것은 세포질 소기관 루멘 사이이다. 예를 들어, 소포체 (ER) ^{멤브레인을} 저감 ^한 환경 세포질에서 ER의 루멘 내 산화성 환경을 분리한다. 막 단백질은 ER-관련 리보솜에서 합성하고, ER 막 ² 내에서 최종 토폴로지를 얻을 수있다. 단백질에 적합한 막 방향 및 토폴로지의 인수는 정상적인 기능을 위해 중요하다. 정확한 토폴로지가 결합 파트너와 상호 작용하는 세포막 단백질의 중요한 영역을 허용 그것은 중요한 번역 후 변형이 발생할 수 있고, 세포막 단백질의 경우, 세포와 상호 작용하고 t를 응답 할 수환경을 오. 완전히 세포막 단백질의 기능을 이해하려면 그 단백질이 존재하는 막 내, 즉, 그 막 토폴로지에 대해 배향되는 방법을 알고 명백히 필수적이다. 막 단백질은 약리학 타겟 ^(3)의 대부분을 포함 이후 단백질 표면의 양태는 다른 환경에 노출되는 세포막 단백질 어느의 토폴로지를 이해하는 기초 과학 기술의 취득 이외에 임상 적 의미를 표시하고있다. 최근까지, 시간과 비용에 상당한 투자를 필요거나 구하기 어려운 시약을 요구 한 막 단백질 토폴로지를 결정하는 접근한다....

프로토콜

형광 단백질 키메라 1. 생성 및 검증

1. 표준 재조합 DNA 전략 ^(13)를 사용하여 관심의 대상이되는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 추가.
   참고 : 우리가 광범위하게 GFP를 사용하고 있지만, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP)와 같은 다른 변종 DsRed의 및 mCherry가 이용 될 수있다. 형광 접는 효율성, 밝기와 광 안정성의 개선이 지속적으로 이루어지고 있으며, 연구자들은 최신 구조의 자신을 소용합니다.
   1. 정확한 DNA 서열을 확인하고 GFP 부분이 관심의 단백질과 프레임에 있는지 확인하십시오. 표준 재조합 DNA 전략 ^(21)를 사용하여 시퀀싱을 수행합니다.
      참고 : 많은 기관이 조사가 추가 정보를 문의 권장 핵심 DNA 시설을 가지고있다.
   2. 단일 또는 이중 패스 막 단백질의 경우, 생성융합 단백질 ^(19)의 아미노 및 카르 복실 단말기 버전 모두.
   3. 다중 스패닝 단백질 추정 extramembrane 루프 내에서 GFP뿐만 아니라 말단를 삽입합니다. 단백질은 ER에 translocon 통과 한 후에 신호 서열은 종종 단백질 분해에 의해 절단 될 때 목적 단백질의 아미노 말....

결과

플라즈마 막 투과성으로

효율적인 세포막 투과성으로는 수용성 형광 단백질 (예 : GFP DsRed의) (단계 4)의 사용에 의해 결정된다. 이들 단백질은, 세포에서 발현 될 때, 세포질에서 자유롭게 확산 및 세포막은 (도 2)를 사용하여 투과 가능 토닌 경우 손실된다. 형광 신호의 완전한 소멸 토닌 응용 프로그램의 10 ~ 60 초 이내에 발생한다. 관심의 단백질이 세포 내 소기관과 연관된 확인이 토닌 투과성으로 다음 형광 신호의 보유를 주목함으로써 달성된다.

단백질 분해 효소 처리

세포에 형광 단백질의 관심있는 단백질과 형광 단백질 (GFP, YFP 등) (단계 1), 식 간의 형광 키메라의 성공적인 생성을 이하의 (단계 2), 치료 프로테아제의 투과 가능 세포가 형광.......

토론

막 단백질의 정확한 방향 및 토폴로지들은 적절한 기능을 위해 필수적이다. 막 단백질 토폴로지 이해의 중요성에도 불구하고, 이러한 데이터가 완전히 결여되는 많은 단백질이있다. FPP는 쉽고 효율적인 세포막 단백질 토폴로지를 결정하는 단계로서, 대부분의 실험실에 의해 수행 될 수있는 하나를 제공한다. FPP 방식은 단백질 토폴로지를 결정하기위한 기존의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제공한다. 예를 들어, 관심 ^(31)의 단백질의 다양한 영역을 다시 관한 여러 항체의 패널을 가질 필요가 없다. 많은 경우에 항체의 이러한 패널을 사용할 수 없습니다; 이 새로 복제 된 단백질에 특히 사실이다. 분석은 단일 세포 수준에서 수행 할 수있는 바와 같이, 많은 단백질의 생화학 수량이 하류 생화학 필요하지 않은 이러한 단백질 분해 또는 SDS-PAGE로 분석한다. 실제로, 상대적으로 적은 형질 전환 된 세포를 명확하게 지정하는 데 필요한관심 단백질 토폴로지. 연구자는 상피 세포 나 신경 세포로 형질하기 어려운 세포에서 토폴로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
마운팅 미디어	Dako	CS704

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