쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

Summary

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 세포 유형별 유전자 발현, 후성유전학적 마커 및/또는 단백질 발현의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 것입니다.

Abstract

뇌는 뉴런, 성상세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포를 포함한 4가지 주요 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 뉴런은 뇌에서 가장 풍부한 세포 유형은 아니지만, 행동에 영향을 미치는 직접적인 역할을 감안할 때 이러한 세포 유형 중 가장 널리 연구된 세포 유형입니다. 뇌의 다른 세포 유형도 그들이 생산하는 신호 분자를 통해 신경 세포의 기능과 행동에 영향을 미칩니다. 신경과학자들은 이러한 상호 작용이 신경 기능과 질병에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해하기 위해 뇌의 세포 유형 간의 상호 작용을 이해해야 합니다. 현재까지 단백질 또는 유전자 발현을 분석하는 가장 일반적인 방법은 세포 유형에 관계없이 일반적으로 혈액을 사용하여 전체 조직 샘플의 균질화를 활용합니다. 이 접근법은 신경 기능과 행동에 영향을 미칠 수 있는 유전자 또는 단백질 발현의 일반적인 변화를 조사하기 위한 유익한 접근 방식입니다. 그러나 이 분석 방법은 세포 유형별 유전자 발현과 세포 간 통신이 신경 기능에 미치는 영향에 대한 이해를 높이는 데 도움이 되지 않습니다. 행동 후성유전학의 분석은 디옥시리보 핵산(DNA) 구조의 변형이 장기적인 유전자 발현 및 행동에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 점점 더 중점을 두고 있는 영역입니다. 그러나 이 정보는 개별 신경 세포 유형의 특정 유전자에 존재할 수 있는 후성유전학적 마커와 차등 계통을 감안할 때 세포 유형별 방식으로 분석되는 경우에만 관련성이 있을 수 있습니다. 아래에 설명된 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 기술은 DNA의 유전자 발현, 단백질 발현 또는 후성유전학적 변형에 대한 후속 분석을 위해 개별 신경 세포를 분리하는 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다. 이 기술은 또한 후속 세포 유형 특이적 분석을 위해 뇌에서 보다 구체적인 신경 세포 유형을 분리하도록 수정할 수 있습니다.

Introduction

아래에 설명된 프로토콜의 목적은 세포 유형 특이적 유전자 발현, 단백질 발현 또는 후성유전학적 마커의 후속 분석을 위해 신경 조직의 이질적인 집단에서 개별 세포 유형을 분리하는 것입니다. 뇌는 뚜렷한 전구 세포에서 파생되고 세포 유형 특이적인 특성과 기능을 가진 많은 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 이러한 차이에도 불구하고 이러한 뚜렷한 신경 세포 유형은 유사한 수용체와 세포 내 신호 분자를 발현할 수 있으며, 이로 인해 이러한 유비쿼터스 단백질의 분석을 기존 방법을 사용하여 세포 유형 특이적 방식으로 측정하거나 해석하기 어렵게 만듭니다. 신경과학자들은 뇌에서 이러한 고유한 세포 유형의 기능과 활성화를 규명해야 하며, 궁극적으로 신경 및 신경 정신 질환에 대한 보다 구체적인 약물 및 치료 표적을 식별하기 위한 첫 번째 단계가 될 것이기 때문에 이러한 세포 유형이 개별적으로 행동에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 확인해야 합니다. 신경 과학 연구의 이러한 중요한 목표에도 불구하고 유전자 또는 단백질 발현, 신호 분자의 활성화 또는 DNA의 후성유전학적 마커 수정을 분석하기 위해 뇌에서 개별 신경 세포 유형을 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 현재 사용되는 기술 중 면역조직화학은 세포 유형 특이적 마커의 추가 염색과 결합할 때 세포 유형 특이적 방식으로 단백질의 발현을 식별할 수 있지만, 이는 관심 단백질에 대해 적절하게 염색할 수 있는 특정 항체에 의존하며 정량화하기 어려울 수 있습니다. In situ hybridization은 뇌의 개별 세포에서 메신저 리보핵산(mRNA)의 특정 국소화를 확인할 수 있지만, 이는 특정 세포 유형의 공동 분석을 제한하고 하나 또는 몇 개의 관심 유전자만 분석할 수 있는 힘든 과정입니다. 레이저 캡처 미세 해부는 레이저를 사용하여 현미경을 통해 시각화된 세포의 하위 집단을 분리합니다. 그러나 이 공정의 시간 소모적인 특성과 상대적으로 낮은 수율로 인해 특히 이러한 분자의 발현이 처음부터 낮은 경우 단백질 또는 mRNA 수준의 후속 분석이 크게 제한될 수 있습니다. FACS(Fluorescence activated cell sorting)는 유전자 발현¹ 및/또는 후성유전^{학적 표적2}의 후속 분석을 위해 뇌에서 개별 세포 유형을 분리하는 신경과학 분야에서 비교적 새로운 기술입니다. 이 프로세스는 세포 유형별 유전자 발현, 단백질 발현 또는 후성유전학적 마커의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 데에도 사용할 수 있습니다. FACS는 수십 년 동안 암 및 면역학과 같은 여러 의학 연구 분야에서 물리적 또는 생화학적 특성에 따라 다양한 세포를 계수하고 분류하는 데 사용되어 왔습니다³. 또한 유세포 분석은 특정 항체를 사용하여 세포별로 단백질 발현을 분석하는 데 전통적으로 사용되어 왔습니다. 아래에 설명된 절차는 분자생물학 종말점의 후속 분석을 위해 개별 세포 유형을 분리하기 위해 고전적인 유세포 분석 기술을 활용합니다. 유세포 분석기는 1초에 수천 개의 세포를 분석할 수 있으므로 위에서 설명한 기술에 대한 빠르고 효율적인 대안이 됩니다. 또한 특정 단백질(예: 신경전달물질 수용체)의 세포 발현 또는 두 개 이상의 단백질 조합(특정 세포 유형에서 여러 단백질의 공동 국소화)을 기반으로 세포를 분리할 수 있습니다. 이를 통해 사용자는 분자 특성에 따라 매우 선택적인 신경 세포 유형을 분리하여 뇌에서 신경 세포의 기능을 식별할 수 있습니다.

FACS를 수행하기 위해 신경 세포는 분석을 위해 광선과 레이저를 통해 단일 파일을 통과하도록 세포를 운반하고 정렬하는 플로우 셀을 통과하는 단일 세포 현탁액으로 준비됩니다. 컴퓨터는 각 셀에서 데이터를 수집하고 지정된 매개변수(크기, 입도 및 형광)를 분석하기 위해 히스토그램에 표시합니다. 이러한 매개변수를 기반으로 세포를 별도의 튜브로 즉시 분류하여 원하는 종말점에 대한 회수 및 후속 분석을 수행할 수 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 3개의 항체를 사용하여 뉴런(Thymocyte 항원 1, Thy1 항체 사용), 성상세포(glial glutamate 수송체, GLT1 항체 사용) 및 microglia(분화 분자 11B, CD11b 항체 클러스터 사용)를 분류합니다. 이 프로토콜은 아래와 같이 사용하거나 자신의 실험을 위해 분리하고자 하는 세포 유형에 따라 다른 항체로 수정할 수 있습니다.

이 프로토콜이 특정 실험에 적합한지 여부를 결정할 때 고려해야 할 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 한 가지 주요 주의 사항은 분리하고자 하는 특정 세포 유형과 관련이 있을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 세 가지 항체는 세포 외 항체로, 실험자가 염색 절차 중에 세포 유형을 그대로 유지하여 내부 RNA, DNA 및 단백질의 무결성을 보존할 수 있습니다. 특정 세포 내부에서만 발현되는 단백질을 식별하는 항체를 사용하여 특정 신경 세포 유형을 분리하기를 원할 수 있습니다. 예를 들어, 티로신 하이드록실라제에 대한 항체를 사용하여 도파민 뉴런을 분리하거나 콜린 아세틸전이효소에 대한 항체를 사용하여 아세틸콜린 뉴런을 분리할 수 있습니다. 이러한 단백질은 세포 내에 있으므로 적절한 항체로 후속 염색하기 위해 세포막의 고정 및 투과화가 필요합니다. 이것은 ^4,5 이전에 행해졌지만, 이 과정은 이러한 투과화된 세포로부터 RNA 또는 DNA의 수율을 현저하게 감소시킬 수 있다. 또 다른 주의 사항은 모든 항체가 FACS에 적합한 것은 아니라는 것입니다. 예를 들어, 현재 단백질의 변성을 필요로 하는 기술인 웨스턴 블롯(western blot)에 매우 잘 작동하는 항체를 사용할 수 있습니다. 이 항체는 단백질이 이 프로토콜의 어느 지점에서도 변성되지 않으므로 항체가 고유한 항원에 결합할 방법이 없을 수 있다는 점을 감안할 때 FACS를 사용하여 이러한 세포 유형을 식별하는 데 반드시 적합한 것은 아닙니다. 회사는 항체가 승인된 응용 분야를 식별하는 사양 시트를 제공합니다. 항체가 유세포 분석에 대해 승인되지 않은 경우, 특정 항체로 이 프로토콜을 시도하는 것을 방해해서는 안 됩니다. 그러나 FACS에서 작동한다는 보장은 없다는 점을 알고 있어야 합니다. 이 프로토콜의 세 번째 주의 사항은 분리하려는 세포의 수와 관련이 있습니다. FACS는 작은 조직 조각에서도 가능한 한 많은 세포를 얻을 수 있는 훌륭한 기술이지만, 상대적으로 작은 뇌 영역에서 상대적으로 희박한 세포 집단을 분리하려는 경우 한 동물의 수율이 본질적으로 낮을 수도 있습니다. 이 경우, 후속 분석에 필요한 세포 수를 산출하기 위해 동일한 치료 그룹에 있는 몇 마리의 동물에서 뇌 조직을 풀링해야 할 수도 있습니다. 그러나, 최근의 한 간행물은 더 큰 세트의 정렬된 뉴런으로부터 소수의 활성화된 뉴런(5-6%)으로부터 유전자 발현의 후속 분석을 위해 cDNA의 유전자 표적화 사전 증폭을 사용했는데, 이는 많은 수의 동물을 풀링하지 않고도 신경 세포의 작은 부분집합에서도 유전자 발현을 분석하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다⁶이 기술의 마지막 주의 사항은 너무 멀지 않은 곳에 있는 세포 분류기에 접근할 수 있어야 한다는 것입니다. 세포 분류기는 올바르게 사용하기 위해 상당한 교육이 필요한 복잡한 기계입니다. 따라서 이러한 기계는 핵심 시설에서 자격을 갖춘 기술자가 운영하는 경우가 많습니다. 또한 이 절차의 목표는 신경 조직을 해리하고 특정 항체를 위해 염색한 다음 짧은 시간(아마도 반나절) 내에 해당 샘플을 즉시 분류기로 가져가는 것입니다. 이 기간은 분리된 세포의 생존과 수율을 높이고 후속 처리 및 분석을 위해 세포의 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 위에서 설명한 이러한 모든 매개변수가 충족되면 FACS는 신경 조직에서 유전자 및 단백질의 세포 유형 특이적 발현을 분석하는 탁월한 방법입니다.

모든 실험은 델라웨어 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드에 따라 수행되었습니다.

Protocol

1. 조직 채취 준비 (15 – 30 분)

1. 직경이 감소하는 유리 파스퇴르 피펫 3 세트를 파이어 폴리싱하고 "1"= 약 1mm 직경, "2"= 약 0.75mm 직경, "3"= 약 0.50mm 직경으로 번호를 매깁니다.
2. Neural Dissociation Kit와 함께 제공된 프로토콜에 따라 동결건조된 효소 A를 모든 Buffer A로 재현탁합니다(재료 표 참조). 소용돌이치지 마십시오. 용액을 50μl 분취액으로 분취하고 나중에 사용할 수 있도록 -20ºC에서 보관합니다.
3. 살균을 위해 미엘린 제거 완충액 1L와 진공 필터를 만듭니다[미엘린 제거 완충액 = 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS) 1,000ml, 500mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2ml, 소 혈청 알부민(BSA) 10g].
4. 나일론 메쉬 시트를 알루미늄 호일로 덮인 작은 비이커에서 세포 파편과 오토클레이브를 여과하는 데 사용할 작은 1 x 1인치(2.5 x 2.5cm) 정사각형으로 자릅니다.
5. 세척 완충액 1L[세척 완충액 = 0.1M PBS 1,000ml, 500mM EDTA 2ml, BSA 10g]를 준비합니다.

2. 조직 수집

1. 수조를 37ºC로 켭니다.
2. Buffer X에 베타-메르캅토에탄올을 최종 농도 0.067mM까지 첨가하여 Neural Dissociation Kit에서 Buffer X를 준비합니다(4개 샘플의 경우 13.5μl의 50mM 베타-메르캅토에탄올 10ml를 Buffer X 10ml에 첨가).
3. Neural Dissociation Kit의 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플에 대해 50μl의 효소 P와 1,900μl의 Buffer X를 혼합하여 Enzyme Mix 1을 준비합니다.예를 들어, 4개의 샘플에 대해 200μl의 효소 P와 7,600μl의 Buffer X를 혼합합니다.
4. 버퍼 X를 37ºC의 수조에 넣습니다.
5. 차가운 행크 완충염 용액(HBSS) 2ml(Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 제외)를 각 샘플에 대해 멸균 6웰 배양 플레이트의 한 웰에 넣고 조직 해부를 위해 얼음에 보관합니다.

3. 조직 해부 (45 분 – 1 시간)

1. IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 동물에게 적절한 양의 안락사 용액(상업용 바르비투르산염 용액, 예: Euthasol)을 주입하고 모든 혈액을 차가운 0.9% 식염수로 관류합니다.
   1. 쥐에게 안락사 용액을 과다 투여합니다.
   2. 호흡과 발가락 꼬집기를 통해 마취를 모니터링합니다. 동물이 충분히 마취되면(발가락 꼬집음에 반응이 없고 깊고 느린 호흡) 쥐를 관류할 수 있습니다.
   3. 쥐를 관류시키려면 튼튼한 가위로 흉강을 잘라냅니다. 심장까지 접근할 수 있도록 횡격막을 자릅니다. 심장에 완전히 접근할 수 있도록 양쪽을 따라 가슴 위쪽까지 갈비뼈를 자릅니다. 이 시점에서 흉곽은 한 쌍의 지혈기를 사용하여 옆으로 잡을 수 있습니다.
   4. 전기 펌프에 부착된 18G 바늘(성체 쥐의 경우)을 심장의 좌심실에 삽입하여 심장 관류를 수행합니다. 펌프는 차가운 0.9% 식염수를 끌어올리고 있습니다.
   5. 그런 다음 작은 가위로 오른쪽 심방을 잘라 혈액과 액체가 몸에서 배출
   되도록 합니다.
   6. 쥐에게 약 10ml(성체 쥐의 경우)의 0.9% 식염수를 관류하여 모든 말초 면역 세포 및 인자를 제거합니다.
2. 멸균 면도날과 적절한 해부를 사용하여 뇌 영역의 원하는 부분을 절개한 다음 조직 조각을 Ca²⁺ 및 Mg²⁺.
   없이 차가운 HBSS에 넣습니다. 참고: 프로토콜은 Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 HBSS가 필요한데, 이러한 이온이 신경 해리에 필요한 효소를 방해할 수 있기 때문입니다.
3. 모든 조직 샘플을 채취한 후 조직 처리를 위해 클린 벤치 또는 멸균 배양 후드로 돌아갑니다.

4. 신경 해리 (1 시간)

1. 6웰 배양 플레이트의 뚜껑에 있는 멸균 면도날을 사용하여 각 조직 샘플을 작은 조각으로 깍둑썰기합니다. 이 프로토콜은 약 30 - 100 mg의 조직 샘플에 사용되었지만, 최대 400 mg의 조직 샘플에 대해 승인되었습니다. 400mg보다 큰 조직 샘플의 경우 시약 부피를 적절하게 확장해야 합니다.
2. Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 신선한 HBSS 1ml를 사용하여 피펫으로 깍둑썰기한 조직 조각을 멸균 2ml 원심분리 튜브에 옮깁니다. 모든 샘플에 대해 4.1단계와 4.2단계를 반복합니다.amp모든 샘플이 2ml 원심분리기 튜브로 옮겨졌습니다.
3. RT에서 2분 동안 300 x g에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
4. 단계 2.2 및 2.3에서 준비한 대로 1,900μl의 따뜻한 Enzyme Mix 1을 각 샘플에 추가하고 튜브를 닫습니다.
5. 37ºC 수조에서 15분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 조직 조각을 다시 현탁시킵니다.
6. 한편, 20μl의 Buffer Y와 10μl의 해동된 Enzyme A를 혼합하여 Enzyme Mix 2를 준비합니다(4개의 샘플에 대해 80μl의 Buffer Y와 40μl의 해동된 Enzyme A를 혼합).
7. 각 샘플에 30μl의 Enzyme Mix 2를 추가하고 부드럽게 뒤집습니다. 소용돌이치지 마십시오.
8. 파스퇴르 피펫 "1"로 각 조직 샘플을 해리하고 위아래로 30회 분쇄합니다.
9. 37ºC 수조에서 15분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 조직 조각을 다시 현탁시킵니다.
10. 파스퇴르 피펫 "2"로 각 조직 샘플을 해리하고 위아래로 30회 분쇄합니다. 거품을 생성하지 마십시오.
11. 파스퇴르 피펫 "3"으로 각 조직 샘플을 해리하고 위아래로 30회 분쇄합니다. 거품을 생성하지 마십시오.
12. 37ºC 수조에서 10분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 세포를 다시 현탁시킵니다.
13. 15ml 팔콘 튜브 위에 놓인 80미크론 세포 균주에 단일 세포 현탁액을 적용하여 큰 파편을 제거하고 10ml의 HBSS(Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 포함)로 필터와 세포를 세척하여 효소 반응을 중지합니다. 각 샘플이 깨끗한 15ml 매 튜브로 옮겨질 때까지 반복합니다.
14. RT에서 10분 동안 300 x g에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.

5. 미엘린 고갈 (45 분)

1. 400 μl의 미엘린 제거 완충액으로 세포 펠릿을 철저히 다시 현탁시킵니다.
2. 지정된 양의 미엘린 제거 비드와 피펫을 위아래로 넣어 완전히 섞습니다.
   참고: 사용되는 미엘린 제거 구슬의 양은 조직의 크기, 동물의 나이 및 특정 뇌 영역에서 예상되는 미엘린의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 성체 쥐 해마 샘플(약 300mg)의 경우 100μl의 미엘린 제거 비드로 샘플을 배양합니다.
3. 4ºC의 냉장고에서 15분 동안 배양합니다.
4. 각 샘플을 5ml의 미엘린 제거 버퍼로 세척합니다.
5. 300 x g에서 RT에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.
6. 샘플을 원심분리하는 동안 마그네틱 소터의 자기장에 각 샘플당 1개의 컬럼을 배치하고 각 컬럼 위에 깨끗한 80미크론 필터를 놓습니다.
7. 컬럼을 준비하고 각 컬럼을 미엘린 제거 완충액 1ml로 3회(총 3ml) 헹궈 걸러냅니다. 모든 흐름은 빈 팁 상자 바닥과 같은 폐기물 용기에 수거합니다.
8. 샘플 채취를 준비하기 위해 5ml의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브를 각 컬럼 바로 아래에 놓습니다.
9. 세포가 원심분리를 마치면 상층액을 흡인하고 500μl의 미엘린 제거 완충액을 완전히 재현탁합니다. 즉시 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고 아래 튜브에 세포를 수집합니다.
10. 필터와 컬럼을 1ml 미엘린 제거 버퍼로 4회(총 4ml) 세척합니다.
11. RT에서 10분 동안 300 x g의 세포 채취를 원심분리합니다.
12. 상층액을 흡인하면 이제 세포를 염색할 준비가 됩니다.

6. FACS를 위한 살아있는 세포 염색(염색 1시간)

1. 펠릿을 분리하고 즉시 5 μl의 Fc 블록 (분화 방지 클러스터 32, CD32)을 추가하고 다시 와류를 일으키고 5 분 동안 4ºC의 냉장고에서 배양하기 위해 세포를 간단히 와류 (2 초)시킵니다.
2. 한편, 세척 완충액 100μl당 0.125μl의 allophycocyanin(APC) 접합 CD11b 항체(1:800), 1μl의 anti-GLT1 항체(1:100) 및 0.4μl의 Fluorescein isothiocyanate(FITC) – conjugated Thy1 항체(1:250)를 추가하여 1차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플은 배양을 위해 100μl의 1차 항체 혼합물을 받습니다. 그러나 샘플이 400mg의 조직보다 훨씬 큰 경우 그에 따라 1차 항체 혼합물의 부피를 늘리는 것을 고려할 수 있습니다
3. 각 샘플 튜브에서 2μl의 세포만 제거하고 각 단일 염색 제어 튜브에 추가하여 단일 염색 대조군을 위한 튜브를 준비합니다. "단일 염색" 대조군에는 APC-CD11b 전용, GLT1 전용, FITC-Thy1 단독 및 PE 2차 항체 및 "공백" 또는 염색되지 않은 대조군이 포함됩니다.
   참고: 모든 샘플은 모든 염색 대조군에 표시되어야 하므로 각 샘플의 세포 2μl를 각 염색 대조 튜브에 추가해야 합니다.
4. 튜브를 간단히 와류(2초)하고 각 샘플 튜브에 100μl의 1차 항체 혼합물을 추가하고 각 염색 대조 튜브에 100μl의 적절한 1차 항체를 첨가한 다음 튜브를 다시 소용돌이치게 하고 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 형광 항체를 보호하고 4ºC의 냉장고에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 샘플은 샘플과 항체의 무결성을 유지하기 위해 나머지 절차 동안 서늘하게(4ºC에서) 유지해야 합니다.
5. 튜브를 간단히 소용돌이치고 각 튜브에 2ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
6. 350 x g에서 4ºC에서 5분 동안 원심분리기 튜브.
7. 한편, 세척 완충액 100μl당 PE 접합 토끼 2차 항체 0.2μl를 첨가하여 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플은 100μl의 2차 항체 혼합물을 얻습니다. 그러나 샘플이 400mg의 조직보다 훨씬 큰 경우 그에 따라 1차 항체 혼합물의 부피를 늘리는 것을 고려할 수 있습니다.
8. 원심분리가 완료되면 각 샘플의 상등액을 싱크대에 버리고 종이 타월로 튜브를 거꾸로 닦아냅니다.
9. 튜브를 간단히 와류로 처리하고 각 샘플 튜브에 2차 항체 혼합물 100μl를 추가하고 각 염색 대조군에 적절한 2차 항체를 추가한 다음 튜브를 다시 소용돌이치게 하고 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 4ºC의 냉장고에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.
   참고: GLT1 전용 염색 조절 튜브는 2차 항체 혼합물을 가져와야 합니다.
10. 배양 후 튜브를 잠시 와류로 돌리고 각 튜브에 2ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
11. 350 x g에서 4ºC에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
12. 원심분리가 완료되면 각 샘플의 상등액을 싱크대에 버리고 종이 타월로 튜브를 거꾸로 닦아냅니다.
13. 튜브를 소용돌이치고 각 튜브에 0.25ml의 멸균 PBS를 추가합니다. 샘플을 정렬할 준비가 되었습니다.
    참고: 더 많은 세포에 0.5ml의 멸균 PBS가 필요할 수 있습니다. 그러나 세포가 너무 농축되어 있으면 샘플이 항상 희석될 수 있으므로 더 낮은 부피로 시작하는 것이 가장 좋습니다.
    참고: 선택적으로 DNase를 튜브에 추가하여 세포가 응집되어 분류기가 막히는 것을 방지합니다. 또한 선별기 막힘을 방지하기 위해 분류 직전에 멸균 80미크론 필터를 사용하여 샘플을 여과할 수 있습니다.
14. 얼음 위의 세포를 분류기로 가져갑니다. 각 튜브에 0.5ml의 멸균 PBS가 있는 2ml nuclease-free 원심분리 튜브에서 세포 집단을 수집합니다.
15. 분류 후 4ºC에서 2분 동안 300 x g에서 세포를 스핀다운합니다. 대부분의 PBS를 흡인하고 RNA 추출(추가 프로토콜 세부 정보는 1 참조), DNA 추출(추가 프로토콜 세부 정보는 2 참조) 또는 단백질 분석을 위한 세포 용해를 위한 추가 처리가 완료될 때까지 -80ºC 냉동고에서 세포를 급속 동결합니다.

Results

수초 고갈과 조직 관류의 중요성

그림 1은 미엘린 고갈의 중요성을 보여줍니다. 미엘린 고갈(위 프로토콜의 5.1단계부터 5.12단계까지)은 단일 세포 현탁액이 미엘린 제거 비드에서 배양되고 세척된 후 자기 분류기의 컬럼을 통과할 때 발생합니다. 이 단계의 목적은 각 샘플에 존재하는 세포 파편의 양을 줄이는 것입니다. 뉴런이 해리되고 분쇄됨에 따라 일반적으로 수초화된 과정을 절단할 수 있으므로 Thy1 항체로 양성으로 염색될 수 있습니다. 그 결과 수초화된 파편이 생성되어 궁극적으로 항체 염색 및 세포 분류를 방해할 수 있습니다. 또한 각 샘플에서 검색되는 상대적인 셀 수를 줄일 수 있습니다. 그림 1에서 그림의 각 패널에 그려진 다각형은 후속 분류를 위해 게이트되고 분석될 살아있는 세포를 나타냅니다. 살아있는 세포에 대한 이 게이트는 크기를 측정하는 전방 산란(FSC)과 해당 입자를 통과하는 빛의 입도 측정인 측면 산란...

Discussion

다른 많은 조직 및 시스템과 마찬가지로 뇌는 행동에 영향을 미치기 위해 함께 기능하는 이질적인 세포 집단으로 구성됩니다. 이질적인 집단 내의 개별 세포의 유전자 발현, 단백질 발현 또는 후생유전학적 변형을 분석하면 시스템 전체의 기능에 대한 정보를 밝히고, 정상적인 행동과 질병 과정을 모두 조절하는 세포 과정을 식별하고, 잠재적인 치료법을 위한 세포 유형 특이적 표적을 제공할 수 있습니다. 미래에는 뇌 내 단일 세포 유형의 기능을 수정하면 신경퇴행성 또는 신경정신과적 장애를 보다 구체적인 방식으로 성공적으로 치료하고 여러 세포 유형에 영향을 미쳐 발생하는 비특이적 부작용을 줄이는 열쇠가 열릴 수 있습니다. 따라서 향후 신경과학 연구의 핵심 초점은 뇌에서 다양한 세포 유형의 상호 작용과 이것이 행동 및 질병 상태에 미치는 영향을 이해하는 것입니다. 여기에 설명된 FACS 기술의 목표는 후속 분석을 위해 개별 세포 집단을 신속하게 분리하는 것입니다. 또한 관심 있는 연구에 따라 보다 구체적인 세포 유형을 분석하도록 수정할 수도 있습...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
신경 해리 키트 (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
미엘린 제거 구슬 II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS 기둥	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS 분리기	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
나일론 메쉬 시트	Amazon	CMN-0074-10YD	40인치 너비, 80미크론 크기 메쉬
Fc 블록/안티-CD32	BD Biosciences	쥐에 대한	BDB550270
APC 결합 CD11b 항체	Biolegend	201809	반응
쥐 토끼 Anti-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	쥐 또는
인간 PE 활용 항토끼에 대한 반응성 2차 항체	eBioscience	1037259	anti-GLT1
FITC-conjugated anti-rat CD90 (Thy1) 마우스 항체	Biolegend	202504	rat에 대한 반응성