이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.
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방법 논문
동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
성인 신경 새로운 뉴런 점점 커미트 중간 선조 아형을 통해 활성화 된 신경 줄기 세포에서 생성되는 고도로 조절되는 다단계 공정이다. 이들 아형 각각은, 함께, 특정 형태 학적 기준 그들의 식별을 위해 이용 될 수있는 특정 분자 표지의 집합을 표현한다. 일반적으로, 면역 형광 기법은 엑소 또는 내생 증식 마커와 함께 하위 특정 항체를 포함하는 적용됩니다. 우리는 여기에 성인 해마 신경 세포의 모든 단계의 검출과 정량 방법을 immunolabeling에 대해 설명합니다. 이들은 티미 딘 유사체, transcardial 관류, 조직 처리, 열 - 유도 에피토프 검색, 면역 조직 화학 ABC 여러 간접 면역 형광 공 초점 현미경 및 셀 정량의 적용을 포함한다. 또한 우리는 문제 U를 피하는 순차적 여러 면역 형광 프로토콜을 제시sually 같은 숙주 종에서 발생하는 일차 항체를 사용하는 필요성으로부터 발생. 그것은 하나의 섹션 내에서 증식 마커와 함께 모든 해마 전구 부속 유형의 정확한 식별을 할 수 있습니다. 이러한 기술은 병렬로 다른 전구 서브 타입의 조절, 뇌 병변에서의 참여와 특정 뇌 기능에서의 역할을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다.
서론
두 뇌 영역 구조적으로 생활 전반에 걸쳐 새로운 신경 세포를 생성, 측뇌실의 뇌실 영역과 해마 치아 이랑 (DG)의 subgranular 영역 (SGZ). 신생아 신경 세포는 신경 전구 세포에서 파생 만기 1, 2에 도달하기 전에 형태 학적 및 생리 학적 개발의 여러 단계를 통해 이동합니다. 천천히 나누어 방사형 아교 세포와 같은 줄기 세포 (유형 1)에서 대중 교통의 연속적인 단계는 중간 전구 세포가 발생 증폭. 더 미분화 하위 유형 (유형 2A와 2B 형)는 짧은 접선 프로세스와 불규칙한 형상을 갖는다. 그들은 (수상 돌기는 분자 층으로 확장 포함) 점차적으로 미성숙 신경 세포가되기 위해 세포주기를 종료하고 마지막으로 해마 네트워크 성숙 과립 세포로 통합 neuroblasts (유형 3)을 생성합니다. 특정으로 인해 생리적 특성이 향상된 세포 가소성 삼 sugges으로 회로를 제공한다팅 해마의 기능에 고유 한 역할. 사실, 지난 십 년간의 연구는 성인 신경이 공간 기억, 패턴 분리 및 정서적 행동 4,5에 기여한다는 상당한 증거를 생성합니다.
성인 신경은 서로 다른 접근 방법을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 티미 딘 유사체는 세포주기의 S-단계에서 DNA에 통합하는 신생아 세....
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프로토콜
참고 : 살아있는 동물을 포함한 모든 절차는 EC 지침 6백9분의 86가 / EEC 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 지침과 지역 윤리위원회 (링거 Landesamt에 대 한 Lebensmittelsicherheit 싶게 Verbraucherschutz)의 승인에 따라 수행되었다.
티미 딘 유사체 1. 복강 내 주사
- 주입하기 전에 동물에게 하루의 무게를. 다음 날뿐만 아니라, 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액의 중량 개별 조정 주입량에 계획된 모든 주사에 필요한 아날로그 티미 딘의 양을 계산한다.
- 10 ㎎ / ㎖ 티미 딘 주식 솔루션을 준비합니다. (주의! 티미 딘 유사체 독성이. 화학 흄 후드를 사용, 즉, 공급 업체가 제공하는 특정 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 따라 실험실 코트와 장갑을 착용).
- 냉장고에서 티미 딘 아날로그를 타고 약, RT에 가져다. 21 ° C. 10 mg의 무게 추가0.04 N의 NaOH (BrdU의 및 CldU 용) 멸균 식염수 (멸균 식염수에, IDU)에, 소용돌이. 50 ° C의 물을 욕조와 소용돌이에 15 분마다 2 - - 분말을 용해 3 분을 적어도 10를 배치합니다.
참고 : 최대 24 시간....
- 냉장고에서 티미 딘 아날로그를 타고 약, RT에 가져다. 21 ° C. 10 mg의 무게 추가0.04 N의 NaOH (BrdU의 및 CldU 용) 멸균 식염수 (멸균 식염수에, IDU)에, 소용돌이. 50 ° C의 물을 욕조와 소용돌이에 15 분마다 2 - - 분말을 용해 3 분을 적어도 10를 배치합니다.
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결과
우리는 정량화 및 출생 후 성인 해마에서 신생아 세포의 특성을 위에서 설명한 방법을 적용했다. 따라서, 우리는 야생형 및 신경 결핍 사이클린 D2는 신경의 비율 (즉, 농축 환경, EE) 13, 14에 영향을 미치는 것으로 알려진 조건에서 보관 (Ccnd2 KO) 마우스를 내라 사용. Ki67, BrdU의, CldU 또는 이두 중 하나에 대한 면역 조직 화학 DAB 염색은 지속적으로 야생형과 Ccnd2 KO 마우스 (그림 3) (15) 사이의 신생아 세포 수의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한, CldU 및 이두의 연속 몰 주사와 함께 우리는 EE (그림 3C, D)의 특정 기간 동안 태어난 세포 집단을 구별 할 수 있었다. 섹션 3.2.4을 채택 우리는 성공적으로 동일한 신호 강도 및 동시 전송 (그림 4) 후 CldU 및 이두의 우수한 중복을 .......
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토론
정량화와 신생아 세포의 개체군의 식별은 성인 신경 연구의 중심 문제입니다. 성인 신경의 특정 단계에서 발현 된 단백질에 대한 증식 마커 및 항체를 결합하는 것은 이러한 개체군의 면역 검출 할 수있다. 항체 또는 항체 조합 중 일부는 특정 염색 조건을 필요로한다.
합성 티미 딘 유사체로 세포를 분할의 레이블은 아직 성인 해마의 신경 발생 연구를위한 황금 표준입니다. 이 실험을 시작하기 전에 적절한 주입 프로토콜을 고려하는 것이 중요하다. 우리가 일반적으로 50 ㎎ / kg (체중, IP)의 BrdU를 관리하지만, 농도는 실험 조건에 따라 다를 수 8,16 하였다 (300 mg까지 / 볼 루스 주사 kg). 이두와 CldU는 세포 인구의 시간적 차별에 대해 순차적으로 주입하는 경우는 (몰 농도를 주입하는 필수입니다 예를 들면, 42.5 ㎎ / kg CldU 및 / kg IDU 57.5 mg)을 얻었다. 그 티미 딘 유사체는 셀 분할에 독성이있을 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 훌륭한 기술 지원에 대해 S. Tausch에게 감사를 표합니다. 이 작업은 BMBF(Bernstein Focus 01GQ0923) 및 DFG(FOR1738)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 티미딘 아날로그 투여 | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | 독성(돌연변이 유발, 기형 유발) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | 독성(돌연변이 유발, 기형 유발) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | 독성 (돌연변이 유발, 기형 유발) |
| 5-Iodo-2′ -deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | 독성 (돌연변이 유발, 기형 유발) |
| 조직 준비< / em> | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De H ä en | 16005 | 독성, 인화성 |
| 관류 펌프 PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon 실험실 튜빙, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| 공급 바늘, 직선, 21 G, 1.75 mm 올리브 팁, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| 냉동 마이크로톰 Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24웰 세포 배양 멀티웰 플레이트 | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine 증기선 | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm 폴리에스터 메쉬 멤브레인 인서트 | Corning | 3479 | , 6웰 배양 플레이트에 사전 로드 |
| Netwell 15mm 폴리에스터 메쉬 멤브레인 인서트 | 12웰 배양 플레이트에 사전 로드된 | 3477 | |
| Netwell 플라스틱 6웰 캐리어 키트 | 24mm 폴리에스테르 메쉬 멤브레인 인서트용 | Corning | 3521 |
| Netwell 플라스틱 12웰 캐리어 키트 | Corning | 3520 | 15mm 폴리에스터 메쉬 멤브레인 인서트용 |
| Vectastain Elite ABC 키트 | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | 발암성, 감광성 |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; 항원결정기 회수 필요 |
| 토끼 α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris 항체 | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; 항원결정기 회수 필요 |
| 기니피그 IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| 쥐 IgG2a α- BrdU (복수) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | BrdU 검출; DAB 1:500/IF 1:400 |
| 쥐 IgG2a &알파;-BrdU(정제) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | CldU의 탐지를 위해; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| 마우스 IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| 마우스 IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | IdU 검출용; DAB 1:500/IF 1:350 |
| 2차 항체 | |||
| alpha;-기니피그 IgG (H+L)-비오틴 | 디아노바 | 711-065-152 | 1:500 |
| 당나귀 &알파;-쥐 IgG (H+L)-비오틴 | 디아노바 | 712-065-150 | 1:500 |
| 당나귀 &알파;-마우스 IgG (H+L)-비오틴 | 디아노바 | 715-065-151 | 1:500 |
| 염소 &알파;-쥐 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| 당나귀 α-염소 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| 당나귀 α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| 당나귀 α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| 당나귀 α-기니피그 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| 당나귀 α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| 당나귀 α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| 당나귀 α-기니피그 IgG (H+L)-로다민 Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| 염소 α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, 토끼 α에서만 작동합니다.-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment 당나귀 α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment 당나귀 &알파;-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| 노멀 당나귀 세럼 | Merck Millipore | S30 | |
| 노멀 래빗 세럼 | Dianova | 011-000-010 | |
| 노멀 염소 세럼 | Dianova | 005-000-001 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | 무독성 크실렌 대체물 |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | 영구 장착 매체 |
| 현미경 | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss 현미경 LSM | ||
| 710 | Carl Zeiss 현미경 검사 |
참고문헌
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.....
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재인쇄 및 허가
