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방법 논문

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52566

⸱

2015년 4월 27일

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 금 나노막대의 광학 흡수와 관련된 일시적인 가열을 사용하여 신경 세포의 분화 및 세포 내 칼슘 활성을 자극하는 방법을 설명합니다. 이러한 결과는 잠재적으로 신경 보철물 및 신경 과학의 기초 연구에 대한 새로운 응용 분야를 열 수 있습니다.

초록

최근 연구에 따르면 신경은 신경 조직에서 물에 의한 적외선의 흡수와 관련된 일시적인 가열에 의해 다양한 방식으로 자극될 수 있습니다. 이 기술은 자극의 국소화를 증가시키고 조직과의 기계적 접촉을 최소화할 수 있는 잠재력으로 인해 표준 자극 기술을 대체하거나 보완할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 광학적 접근 방식은 가시광선이 조직 깊숙이 침투할 수 없기 때문에 제한됩니다. 더욱이, 열 모델링은 여러 자극 부위 또는 높은 레이저 반복률이 사용될 때 누적 열 효과가 잠재적으로 위험할 수 있음을 시사합니다. 아래에 요약된 프로토콜은 신경 세포의 적외선 자극에 대한 향상된 접근 방식을 설명합니다. 기본 메커니즘은 금 나노막대의 광학 흡수와 관련된 일시적인 가열을 기반으로 하며, 이는 신경 세포 분화를 유발하고 세포 내 칼슘 활성 수준을 증가시킬 수 있습니다. 이러한 결과는 나노 입자 흡수체가 수분 흡수를 기반으로 하는 적외선 신경 자극 과정을 향상 및/또는 대체할 수 있음을 보여주며, 향후 신경 보철물 및 세포 치료에 응용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

최근 연구에 따르면, 물 (파장> 1400 ㎚)에 의해 외광의 흡수와 관련된 과도 가열 한 신경 조직 및 심장 근세포의 세포 내 칼슘이 과도에서 활동 전위를 유도하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 적외선 빛의 사용으로 인해 잠재적 인 미세한 공간 해상도로, 신경 보철에 응용 프로그램에 대한 큰 관심을 제기, 유전자에 직접 조직과 접촉, 자극 유물의 최소화 및 필요성을 제거 부족 (자극하기 전에 세포를 수정 ) optogenetics에 필요 하나. 이러한 모든 장점에도 불구하고, 최근에 개발 된 열 모델은 상기 대상 조직 / 세포 자극 여러 사이트 및 / 또는 고 반복율은 3,4- 사용되는 누적 가열 효과에 의해 영향을받을 수 있음을 제시 하였다.

이러한 과제에 대응하여, 연구자들은 외인성 absor를 사용할 수있는 가능성을 인식하고신경 자극에 대한 조직의 BER이 더 국부 가열 효과를 생성한다. 황 등. 원격 무선 주파수 자계 5 HEK 293 세포에서 온도에 민감한 TRPV1 채널을 활성화하기 위해 페라이트 초상 자성 나노 입자를 사용하여이 원리를 설명했다. 이 기술은 (자기장이 조직에 상대적으로 약한 상호 작용) 더 깊은 침투를 허용 할 수 있지만, 반응은 오히려 생체 공학 장치 (5)에 필요한 밀리 초 지속 시간보다, 초 기간에 걸쳐 기록되었다. 체외에서 검은 마이크로 입자를 쥐의 대뇌 피질 신경 세포의 유사, 파라 등. 입증 전기 자극. 이들은 잠재적으로 더 빠르게 반복 속도 6을 허용 μJ 범위의 에너지와 μS 수백 정도의 펄스 지속 시간을 사용하여 자극 세포 수준의 정밀도를 나타냈다.

외인성 흡수제의 사용은 또한 유도 적용된체외에서 형태 학적 변화. Ciofani 외는. (7)에 의해 여기 된 초음파 압전 질화 붕소 나노 튜브를 사용하여 신경 세포의 생장 ~ 40 %의 증가를 보였다. 마찬가지로, PC12 세포에서 endocytosed 산화철 나노 입자 인해 산화철 8 세포 접착 분자의 활성화, 용량 의존적으로 분화 신경 돌기를 향상시키기 위해보고되었다.

최근, 신경 자극을 지원하기 위해 외부 흡수에 대한 관심은 금 나노 입자의 사용 (금 NP에)에 초점을 맞추고있다. NPS는 효율적으로 AU 플라즈몬 피크에서의 레이저 광을 흡수하는 열 (9)의 형태로 주위 환경으로 방출 할 수있는 능력을 가지고있다. 10 - 가능한 입자 모양의 모든 사이에 금 나노 막대의 광 흡수 (금 NR을)를 편리하게 (NIR, 750-1,400 나노 미터 사이의 파장 적외선 근처) 생체 조직의 치료 창을 일치합니다. 또한, 계속에서신경 자극의 EXT는, Au로 각 NR 사용은 비교적 양호한 생체 적합성 및 표면 기능화 옵션 (11)의 넓은 범위를 제공한다. 최근의 연구 분화에 자극 효과가 NG108-15 신경 세포 12 금 NR을 지속적으로 레이저 노출 후 유도 될 수 있음을 보여 주었다. 마찬가지로, 세포 내 칼슘 과도 가변 주파수 및 펄스 변조 된 레이저 조사 13 길이 Au을 NR을 배양 신경 세포에서 기록되었다. 세포막 탈분극은 나선 신경절 신경 세포 (14)의 차 문화 금 각 NR NIR 레이저 조명 후에 기록되었다. 조사 금 NR을 가진 생체 응용 프로그램의 첫 번째는 최근에 증명되었다. 엄 동료는 플라즈몬 절정에 금 NR을 노출하고 복합 신경 활동 전위 (CNAPs)의 진폭의 6 배 증가 쥐의 좌골 신경의 자극 임계 값의 3 배 감소를 기록했다. 엉진일보 응답은 NR 플라즈몬 피크 (15)의 여기에 의한 발열 효과 지역에 기인 하였다.

본 논문에서는 금 NR을 배양 NG108-15 신경 세포에 레이저 자극의 효과를 조사하는 프로토콜이 지정됩니다. 이러한 방법은 표준 생물학적 기술 및 재료를 사용하여 시험 관내에서 세포 집단을 조사하는 간단하지만 강력한 방법을 제공한다. 프로토콜은 안전하게 작동하고 반복 가능한 정렬을 가능 광섬유 결합 형 레이저 다이오드 (LD)에 기초한다. 금 NR 샘플 준비 및 레이저 조사 방법에있어서, 상기 특정 프로토콜 합성 및 배양을 각각 제공하는 것으로 알려져있다, 다른 입자 형상 및 신경 세포 배양에 확장 될 수있다.

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프로토콜

1. 금 NR을 준비

참고 : 금 NR을 조리법 (16)의 숫자에 의해 합성 또는 상업적 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다.

  1. UV-비스 분광법을 통해, 0.5 nm의 해상도에서 300 내지 1000 nm가 내지 흡수 값을 기록함으로써 금 NR 용액의 초기 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 용액의 부피는 큐벳 가능한 함께 사용하도록 다양하다.
  2. 적합한 기술 (17)의 초기 NP 몰 농도 (예를 들어 UV-비스 분광법, 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법, 투과형 전자 현미경)을 평가하거나 공급 업체에서 제공하는 농도 값을 사용한다.
  3. 가장 재현성 OD = 1 도달 테스트 샘플의 모든 OD를 일정하게 유지하기 위해 초기의 Au NR 샘플을 희석하여 5 ㎖ 스톡 용액을 준비한다. 희석 용매의 조성에 대한 상용 공급 업체의 프로토콜을 따르십시오. 잘 모르는 경우탈 이온수를 사용합니다.
  4. 두 번 15 분 동안 금 NR 용액 1 ml의 7,800 XG에 원심 분리기는 솔루션에서 어떤 화학 초과를 제거합니다. 원심 분리 사이클 힘과 시간 (예를 들면 20 분에서 5600 ×의 g) 18 다를 수 있습니다.
  5. 상층 액을 제거하고 탈 이온수 NR을 다시 일시 중지합니다. 재 부유 입자가 용액에 응집체를 형성 할 수 있듯이, 최상의 결과를 가지고 매일을 준비. 또한, 1 주 이상 더 이상을위한 냉장고에 보관. 냉동하지 마십시오.
  6. 세포 배양 조건에서 사용하기 전에, 5 분 동안의 Au NR 용액을 초음파 처리 한 다음 (MW가 m을 ∙하게는 400보다 -2 254 nm에서 UV 방사 강도)을 30 분 동안 UV 광으로 소독.

2. NG108-15 신경 세포 라인 문화와 차별화

  1. 세포 배양 배지를 들어, 멸균 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 소 태아 혈청 (/ V w) (FCS) 10 %를 함유하는 1 % (w / v)의 L 글루타민, 1 % 500㎖를 준비(w / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5 % (w / v)의 암포 테리 신 B를
    주 : 보조제는 -20 ° C에서 저장, 분주 필요한 날에 배지에 첨가 할 수있다. 세포 배양 배지는 1 개월 최대 무균 상태로 냉각 될 수있다.
  2. 세포 분화 배지를 들어, 1 %를 함유하는 멸균 된 50 ㎖의 DMEM을 준비 L 글루타민, 1 % (w / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.5 % (w / v)의 암포 테리 B. (/ V w)
  3. (37 ° C에서 5 % CO 2) 가습 분위기 인큐베이터 폴리스티렌 T75 플라스크에 세포 배양 배지 10ml에 NG108-15 신경 세포 성장. 일반적으로 3-4 일 내에 준비 될 각 플라스크에 1.5 × 105 세포를 시드. 이틀 세포 배양 배지를 변경합니다.
    참고 : 실험로 (21)보다 오래된 세포를 사용하지 않는, 유전 드리프트 또는 변화를 방지하기 위해.
  4. 때 70~80% 합류는 문화, 따뜻한 신선한 세포 배양 매체 매체를 변경합니다. 기계적 공사 부드럽게하여 세포를 분리왕 합류 플라스크의 바닥. 트립신을 사용하지 마십시오.
  5. 원심 분리기 (600)와 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 다시 일시 따뜻한 세포 분화 배지 2 ㎖로 세포를 펠릿.
  6. 세포 분화 배지 200㎕를 가진 조직 배양 96 웰 폴리스티렌 플레이트에 씨앗 2 × 104 세포 / ㎠. 5 % CO 37분의 2 ℃에서 1 일 동안 실험을 품어.
  7. 2 일에 금 NR 용액 10 0 1 × -4.2 9 10 × 3.2 사이의 입자 / ㎖를 추가하고 추가로 24 시간 동안 그것을 품어. 제어 실험에 입자를 추가하지 마십시오.
    주의 : 다른 컨트롤로서 잘 분화 흡수 극대 파장의 Au NPS는 비교 목적 14에 사용될 수있다. 보다 일관된 셀 동작을 위해서 (때문에)는, 일정한 세포 밀도를 유지하고 세포 파종하기 전에 잘 표면을 수정하지 마십시오.

3. 신경 돌기 성 향상

  1. 한 쌍단일 모드 광섬유와 레이저 (개구 = 0.13)와 (FC 커넥터는 편리하고 일반적으로 사용할 수있는) 섬유 커넥터를 종료합니다. 표준 전력 측정기와 출력 레이저 파워를 측정한다. 가장 효과적인 결과를 얻기 위해서는 각 NR 플라즈몬 공진 레이저 피크의 피크 파장을 일치 시키.
  2. 3 일 다음 NR 배양에서 잘에 FC 커넥터를 고정합니다. 다른 레이저 파워를 들어, 연속 파형에서 1 분 동안 실온에서 샘플 및 컨트롤을 조사. 문화가 5 % CO 37분의 2 ℃에서 추가로 3 일 동안 할 수있게합니다. 세 독립적 인 측정의 최소 레이저 조사를 반복한다.
    주의 : 다른 조사 시간 및 펄스 주파수는 응용에 따라 선택 될 수있다.
  3. 빔 직경과 레이저 방사의 관점에서 레이저를 특성화 (W ∙ cm -2).
    1. 표준 단일 모드 광섬유를 들어, NA = N ∙ 죄 θ를 사용n은 사용되는 매질의 굴절률이고, θ는 출사 광 섬유의 원뿔의 반각이다 (도 1a 참조). R은 빔 반경 삼각법, R = θ ∙ 황갈색 D 및 D에서 섬유와 샘플 사이의 거리이다. FC 커넥터는 따라서 거리 (d)에서 샘플 = 2.70 ± 0.20 mm를 조명 잘의 직경과 일치합니다. 빛, R = 황갈색 (SIN-1 (NA / N))를 제공하는 d의 ∙ (N = 1.33)을 물에 섬유를 종료합니다.
    2. 후자의 방정식을 사용하여, 레이저 빔 반경 대응 빔 영역과 대상에 평균 레이저 조사량 (빔 면적으로 나눈 레이저 파워)를 계산 (도 1b에 예시 그래프를 참조). 이러한 값은 조명 된 영역에 걸쳐 평균 조도를 나타낸다.
    3. 에러 전파의 일반 이론과 측정 오류를 평가합니다.
      참고 : 거리 B를etween FC 커넥터와 샘플은 적절한 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용하여 화상의 실험 장치와 후 처리의 사진으로 측정 할 수있다.
  4. 5 일째, 실험에서 세포 분화 배지를 제거하고 3.7 %를 10 분 동안 (V / V) 포름 알데히드 용액으로 샘플을 고정하고, 0.1 내지 20 분간 (v / v) 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면.
  5. (/ V W) 60 분 동안 샘플을 소 혈청 알부민 (BSA)에 결합 부위 반응을 차단하는 단백질의 3 %를 추가한다. 4 ° C에서 안티 βIII - tubulin의 하룻밤 (PBS에서 / ㎖ 5 μg의이 BSA의 1 %로 보충)에 대한 샘플을 레이블.
  6. PBS에 1 % BSA에서 0.4-2 ㎍ / ml의 농도를 사용하여 (예 TRITC 공액 항 - 마우스 IgG 항체) 적절한 이차 항체로 어두운 90 분 동안 세포를 배양한다. 10 분 동안 DAPI (0.1 ㎍ / ㎖의에 탈 이온수)와 세포 핵 레이블.
    참고 : 항체 활용과 농도 미그를HT는 회사의 프로토콜에 따라 다릅니다. 두 번 각각의 염색 단계 후 5 분 동안 PBS로 세척 샘플.
    figure-protocol-1
  7. 적어도 20 × 목표를 사용하여 표면 형광 또는 공 초점 현미경으로 이미지 샘플. 현미경은 이차 항체에 따라서 필터를 선택. DAPI 필터 선택 (λ EX = 358 nm의, λ EM은 488 나노 미터 =) 세포 핵을 시각화 할 수 있습니다.
  8. 평가함으로써 이미지 분석 : ⅰ) 최대 신경 돌기 길이 (기록 전지 본체의 시작 신경 돌기의 선단까지의 길이)를, ⅱ) 신경 세포 당 신경 돌기의 수 ()는 셀당 신경 돌기를 모두 합산 및 III) 신경 돌기를 가진 세포의 백분율 (적극적으로 핵 염색 세포의 총 수) 19 튜 불린 - βIII을 발현하는 세포의 총 수를 나눈다.

4. 세포 내 칼슘 이미징 레이저 유도

  1. 플루로 닉 F-127 스톡 용액 (/ V w)을 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 10ml에 용질 2g을 용해시켜 20 %를 준비한다. 용해도를 증가시키기 위해 약 20 분 동안 40 ° C에서의 플루로 닉 F-127 용액을 가열한다. RT에 저장된 사전에 준비를합니다.
  2. NR 배양 한 다음 3 일에서 균형 염 용액 준비 (BSS 135 mM의 NaCl을, 4.5 mM의 KCl을, 1.5 mM의 염화칼슘 2, 0.5 mM의의 MgCl 2, 5.6 mM의 혈당, 10 mM의 HEPES, 산도 7.4), 5로 보충 DMSO의 FLUO-4 AM 및 0.1 %의 μM (W / V)로 닉 F-127 솔루션.
    주 : BSS 용액을 미리 제조하고, 1 개월 최대 냉각 될 수있다. 실험의 날에 보충 (FLUO-4 오전 플루 F-127)를 추가합니다.
  3. 세포 분화 배지를 제거하고 BSS 보충 용액으로 교체한다. 반전 공 초점 현미경으로 최상의 결과를 얻으려면 잘 마이크로 슬라이드에 세포를 배양한다.
  4. FLUO-오전 4시 넣 NG108-15 세포5 % CO 37분의 2 ° C에서 어둠 속에서 30 분. 배양 시간에 따라, 어떤 세포 외 언로드 형광 물질을 제거하는 BSS로 두 번 샘플을 씻는다.
  5. 몇 단일 모드 광섬유 레이저와 함께 표준 기술을 사용하여 팁을 절단. (팁은 현미경 검사시 섬유 축에 수직 인 평면이어야 IE) 고품질 표면을 보장하기 위해, 광학 현미경으로 관찰 결과 팁.
    1. 표준 전력 측정기와 출력 레이저 파워를 측정한다. 광섬유 홀더로 빛을 전달 섬유를 삽입하고 마이크로 포지셔너에 부착합니다. 브라운 등의 알을 참조하십시오. (20) 광섬유 준비와 위치에 대한 자세한 내용은.
      주의 : (예 : 레이저 광선을 직접 보지 않는다 처리하는 동안 레이저 안전 고글을 착용, 다른 실험실 사용자에게 미광 노출을 방지) 레이저 파워의 측정하는 동안 레이저 안전에 대한 일반적인 규칙을 따르 <./ 리>
  6. 광 변조를 모니터링하는 휴대용 레이저에 오실로스코프를 연결합니다. 가변 주파수 (0.5 Hz에서) 및 펄스 길이 (20 ~ 100 밀리 초)와 이진 신호를 사용합니다. Paviolo 등.도 13에 도시 된 설치 다음, 현미경 트랜지스터 - 트랜지스터 논리 (TTL)와 같은 변조 된 신호를 입력하여 레이저를 연결한다.
    1. 반전 된 공 초점 현미경으로 세포를두고 떨어져 투과 조명 모드에서 타겟 셀로부터 광 전달 섬유 250 ± 50 ㎛의 위치. 이 거리에서, 타겟에 빔 반경을 계산하도록 3.3.1에 ​​제시된 방정식을 사용한다.
  7. 내면화 FLUO-4 오전 염료를 자극하기 위해 아르곤 이온 레이저 (488 nm의)를 사용 (λ EX = 494 nm의, λ EM 516 나노 미터 =)와 endocytosed NR을의 여기에 대한 동기화 LD를. 시계열 스캔을 수집함으로써, 적어도 40 × 대물를 이용한 샘플 및 컨트롤 RT에서 촬상을 수행256 × 256 픽셀 / 최소 4 Hz의 주파수 왕복 모드에서 프레임 해상도. 임의의 아르곤 이온 레이저 간섭 (잡음 기준)을 식별하는 임의의 LD 여기없이 기록이 행해진.
  8. 적응 적 가중치 범 최소 제곱 알고리즘 (21)을 사용하여 데이터로부터 배경을 제거한다. 시간의 함수로서 유도 된 칼슘의 변화를 플롯. 레벨 기준선 잡음 (3​​σ)의 표준 편차의 3 배를 임계 화함으로써 영상 후 처리 소프트웨어를 사용하여 형광 강도 과도 피크를 분석한다.

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결과

여기에 설명 된 프로토콜 1, 2 및 3을 사용하여 분화에 자극 효과의 Au NP에 배양 NG108-15 신경 세포에서 관찰되었다 레이저 후에 (금 NR을, 폴리 (스티렌)의 Au NR을 실리카 코팅 된 금 각 NR을 코팅 처리) 1.25 및 7.5 W 사이의 노출 · cm -2. rhodamineB 표지 금 NR을 공 촛점 이미지는 입자가 배양 12 일 1 내면화되었다는 것을 보여 주었다. 지역화 주로 흡수 바람직한기구는 전지 본체 (12)를 통해 막임을 나타내는 세포질에서 관찰되었다. NG108-15 신경 세포로 분화를 유도 한 후 검출 된 주요 형태 학적 변화는 확산의 체포, βIII - 튜 불린 단백질의 발현 및 최대 길이와 수 (22)의 측면에서 분석 하였다 신경 돌기의 부산물이었다.

NR을 배양 샘플 레이저 irradi에서 신경 돌기 길이 증가를 보였다여기에 측정 ANCE 수준 (1.25...

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토론

이 프레젠테이션에서 설명하는 프로토콜은 문화, 차별화 광학적으로 외부 흡수를 사용하여 신경 세포를 자극하는 방법에 대해 설명합니다. NR 특성 (예를 들어 치수, 형상, 플라즈몬 공진 파장 및 표면 화학) 및 (등과 파장, 펄스 길이, 반복율, 등)의 레이저 자극 파라미터는 다른 실험의 필요에 맞도록 변화 될 수있다. 세포 행동에 영향은 표준 분석 및 생물학적 물질을 사용하여 모니터링 할 수있다. 전반적인 접근 방법은 체외에서 세포 인구를 조사 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 제공합니다 및 일차 전지, 조직 샘플과 생체 내 연구에서 연장 할 수있다.

금 NR을 생물학적 용도로 사용하기 위해 만족되어야 할 주요 요구 안정성 (화학적 및 물리적 모두) 및 생체 적합성이다. 후자 (인해 양이온 계면 활성제의 존재 때문에, 일반 특히 중요금의 표면에 LY CTAB). CTAB는 시험 관내 및 생체 내

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공개 사항

저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.

감사의 글

저자는 부분적으로 촬영하는 동안 그녀의 도움을 셰필드 씨 Jaimee 메인이 대학이 연구를 호스팅하는 데에 대한 여행 자금 지원을위한 NanoVentures 호주와 교수 존 헤이 콕을 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Au NR시그마 알드리치716812
NG108-15시그마 알드리치8811230
DMEM시그마 알드리치D6546
FCS라이프 테크놀로지10100147
L-글루타민시그마 알드리치G7513
페니실린/스트렙토마이신라이프 테크놀로지스 15140122
Amphotericin BLife Technologies15290018
포름알데히드Sigma AldrichF8775
Triton X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
Anti-β III-튜불린PromegaG7121
TRITC-conjugated anti-mouse IgG 항체, Sigma AldrichT5393
DAPIInvitrogen,D1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma, Aldrich, 472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
UV-Vis 분광계Varian Medical Systems Inc.Cary 50 Bio
Mini 원심분리기EppendorfMini Spin
Sonic bathUnisonics AustraliaFPX 10D
세포 배양 인큐베이터KendroHera Cell 150
세포 배양 원심분리기HettichRotofix 32A
레이저 다이오드Optotech780 nm 단일 모드 광섬유 결합 LD
광섬유Thorlabs780 HP
파워 미터CoherentLaser Check
ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Epifluorescent microscopeAxon InstrumentsImageX-press 5000A
μ -slide wellIbidi80826
Inverted confocal microscopeCarl Zeiss Microscopy Ltd. (자이스 현미경 검사)LSM 510 메타 컨포칼 현미경
오실로스코프텍트로닉스TDS210
스 , , , , , , , , , , , , , ,

참고문헌

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