후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Summary

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

Abstract

전사와 전사 후 조절은 모두 유전자 발현에 지대한 영향을 미친다. 그러나, 일반적으로 채택 세포 기반 스크리닝 분석은 본질적으로 프로모터 대상 분자의 식별을 목표로하고, 전사 조절에 초점을 맞 춥니 다. 그 결과, 전사 후 기전은 주로 유전자 발현 표적 약물 개발에 의해 발견된다. 여기에서 우리는 그것을 수정할 수 화합물을 식별하는 자사의 mRNA의 운명의 변조의 3 '번역 영역 (3'UTR)의 역할을 조사하기위한 셀 기반 분석을 설명합니다. 분석은 안정 질병 관련 세포주에 통합 관심 유전자의 3 'UTR을 포함하는 루시퍼 라제 리포터 구조물의 사용에 기초한다. 프로토콜은 치료 후 24 시간 후 루시퍼 라제 활성에 영향을 미치는 분자 식별 목적 일차 스크리닝에서 초기 포커스로, 두 부분으로 분할된다. 프로토콜의 두 번째 부분설명 카운터 선별 특히 3 'UTR을 통해 루시퍼 라제 활성을 조절 화합물을 구별 할 필요가있다. 프로토콜 상세 및 대표적인 결과 외에, 우리는 분석법 개발 및 내인성 표적에 적중 (들)의 유효성에 대한 중요한 고려 사항을 제공한다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법 과학자 3 'UTR에 종속 전사 후 기전을 통해 단백질 수준을 조절 분자를 식별 할 수 있도록 할 것이다.

Introduction

유전자 발현의 장기간 전사 조절에 단백질 생산을 조절 배타적이지 않은 경우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각 하였다. 축적 된 증거 그러나, 전사 후 조절은 세포 단백질 풍부 ^1,2-를 결정하는만큼, 그렇지 않은 경우, 전사 조절 이상 기여 것을 나타낸다. 유전자 발현의 전사 후 제어는 제 생각에보다 훨씬 더 복잡하고 정교하다. 사실, 전사 후 제어 모든 다양한 단계는 mRNA의 프로세싱, 지역화, 회전율, 번역 ^3뿐만 아니라 새롭게 기재된 가역적 RNA 메틸화 ⁴ 포함한 조절되는 것으로 나왔다. 전사 후 조절 프로세스의 개수가 영향을받을 가능성에서, 분석은 후술 mRNA의 3 '비 번역 영역 (3'UTR)을 포함하는 것들에 집중한다. 3 'UTR는 크게 RNA 결합 홍보의 특정 상호 작용을 통해 주로 mRNA의 운명에 영향을 미칩니다규제 시퀀스 및 / 또는 보조 구조 ⁵ oteins 및 비 코딩 RNA를. 따라서, 이러한 상호 작용을 변경하거나 업스트림 신호 전달 경로를 방해 소분자 단백질 존재 량을 조절하는 밸런스를 이동한다. 이 치료 방법은있는 증거가 질병 관련 유전자를 따라서 약물 학적 개입의 대상이 될 가능성을 나타내는 전사 후 조절,을 실시한다 보여주는 존재하는 인간의 병리 특히....

Protocol

참고 : 이러한 분석 시스템의 처리량이 가능한 HTS 실험실 장비에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 96- 웰 포맷으로 액체 취급을 수행 테칸 프리덤 EVO 로봇 (200)에 의해 용이하게된다. 384- 웰 포맷 소형화도 가능하다. 로봇 액체 핸들링 시스템은 모든 실험 단계에서 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드 아래에 배치된다. 어떤 자동화 액체 처리가 없다면, 프로토콜 용이 낮은 스루풋 포맷으로 구성 될 수있다.

기본 검사

1. 1 일 : 준비 및 종자 세포

주 : 종자 세포는 루시퍼 라제 활성, 즉 시드 후, 48 시간을 분석시 80 % 합류를 얻었다.

1. 재현 탁 10 % FBS, 1 % L- 글루타민을 함유하는 RPMI에서 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 농도로 CHP134-mycn3UTR 신경 아세포종 세포를 트립신 처리. 27 판은 적어도 250 ml의 준비 계정 액 처리 고려 세포 현탁액, 데드 볼륨 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 멸균 저수지에 세포 현탁액을 붓고 로봇 책상에 놓습니다.
2. 9 바코드 흰색 평면 바닥 96 웰 플레이트 및 로봇 책상에 2....

Results

설명 된 접근법을 사용하여, 우리는 MYCN 유전자의 3 'UTR 누두 전사 후 제어 메커니즘의 전위 조절제 위해 2,000 화합물 라이브러리를 스크리닝.도 3은 하나의 라이브러리 플레이트로 예시 일차 스크리닝의 결과를 도시도. 비히클 - 처리 된 콘트롤의 백분율로서 표시 루시페라아제 신호는 단일 라이브러리 플레이트 화합물로 처리-mycn3UTR CHP134 세포 중으로 판에 루시페라아제 활성을 측정함으로써 수득 하였다. 예상 된 바와 같이 100 %에 가까운 값을 기준으로 나타낸 바와 같이, 화합물의 대부분은 루시퍼 라제 활성에 영향을 미치지 않았다. 히트 (일반 사각형)은 평균 값 x와 SD는 모든 분석 값에 대해 계산되는 X ± 2 SD의 임계 값을 설정 선정되었다. 검출 억제 아마 pronou의 결과로 20 % (별표로 표시 한) 아래 루시 페라 제 활동을 감소 화합물은 고려에서 제거해야합니다화합물의 NCED 세포 독성.

Discussion

이 프로토콜은 3' UTR 의존성 전사 후 과정을 표적으로 하는 조절자의 식별을 목표로 하는 세포 기반 리포터-유전자 분석을 설명합니다. 이는 1차 스크리닝과 반대 스크리닝을 포함하며 필요한 경우 세포독성 분석을 동반할 수 있습니다. 1차 스크리닝의 결과는 여러 가지 가치 있는 후보 화합물이며, 이들의 재현성과 특이성은 반대 스크리닝에서 추가로 검증됩니다.

1차 히트의 식별은 리포터-3' UTR 키메라 전사체를 발현하는 세포의 처리 시 루시페라아제 활성의 변화를 기반으로 합니다. 3' UTR 없이 동일한 리포터 플라스미드를 운반하는 세포에서 히트를 다시 테스트하면 진정한 히트(3' UTR 의존성 메커니즘을 통해 루시페라아제 수준을 특이적으로 조절하는 화합물)와 위양성(프로모터의 전사 반응성을 통해 루시페라아제 활성을 변화시키는 화합물)을 구별할 수 있습니다. 1차 적중의 반대 스크리닝에 의해 입증된 바와 같이, 분석은 상당한 위양성률을 보여줍니다⁶. 이러한 제.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
배양 플레이트 96-웰 화이트	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-웰 U 바닥 (희석 플레이트)	PerkinElmer	6008190
100 ml 일회용 시약용 트로프	Tecan	10 613 048
300 ml 일회용 로봇 저장 탱크	VWR	PB12001301
로봇 팁 DITI 50  &뮤; l 멸균	Tecan	30038607
로봇 팁 DITI 200  &뮤; l 멸균	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D 바코드 w, 플랫 바텀 튜브	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase 분석 시스템	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200  mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum 컬렉션 (복합 라이브러리)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 로봇	Tecan	N/A
Tecan F200 멀티플레이트 리더	테칸	해당 없음