바이오패닝 기술과 원자력 현미경을 사용하여 낮은 농도에서도 모든 생물학적 물질에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 음성 및 양성 바이오패닝 시스템을 만들었습니다. 우리는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 관련된 TDP-43 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 데 성공했습니다.
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방법 논문
루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning
이 논문에서
요약
초록
단백질 변형은 TDP-43 루게릭 병에 (ALS)에서, 알파 - 시누 클레인 등 많은 질환에 중요한 역할을하기 때문에 파킨슨 병 및 알츠하이머 병에서 베타 - 아밀로이드와 타우, 그것은 형태 특정 시약을 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다 개발하는 것이 매우 중요하다 이러한 질병 특정한 단백질은 질병 병리학에 잠재적 인 진단 및 치료 응용 프로그램에 대한 이러한 변형의 역할을 연구하는 변종. 우리는 선택적 질병 특정한 단백질 변이체를 인식 시약의 분리를 가능하게 신규 원자력 현미경 (AFM) 계 biopanning 기술을 개발했다. 프로세스, 음성 및 양성 패닝 단계에 관여하는 두 가지 주요 단계가 있습니다. 네거티브 패닝 단계 동안 오프 - 타겟 항원에 대한 반응성이 파지 엄선 오프 표적 항원을 이용한 서브 트랙 티브 시리즈 패닝 여러 발사를 통해 제거된다. 음의 핵심 기능패닝 단계는 프로세스를 모니터링하고 모든 바람직하지 않은 파지 입자를 제거하는 것을 확인하기 위해 AFM을 이용하여 촬상된다. 포지티브 패닝 위상 관심 표적 항원은 운모 표면에 고정되고 결합 된 파지를 용출 선택적 표적 항원에 결합 된 파지를 식별하기 위해 스크리닝한다. 목적 단백질 변이체는 적절한 네거티브 패닝 제어가 사용되어왔다 제공 정제 할 필요가 없다. 심지어 양의 패닝 단계에서 이용 될 수있는 복잡한 생체 물질은 매우 낮은 농도로 존재하는 유일한 단백질 변이체를 타겟팅. 이 기술의 응용 프로그램을 통해, 우리는 선택적으로 인간의 ALS의 뇌 조직에서 발견되는 TDP-43의 단백질 변형에 대한 항체를 인수했다. 우리는이 프로토콜은 선택적으로 다른 생물학적 과정 및 다양한 질병에 존재하는 단백질 변이체를 생성하는 바인딩 시약에 적용 할 것을 기대한다.
서론
단백질 변이체의 존재는 알쯔하이머, 파킨슨, ALS 및 전 측두엽 치매 (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 질환의 진행에 인자로서 연루되어왔다 , 10, 11. 단백질 베타 아밀로이드 및 알파 - 시누 클레인의 올리고머 형태의 알츠하이머와 파킨슨 각각 2,3,4,5에 대한 책임이있는 독성 종 것으로 생각된다. TAR DNA 결합 단백질 43 (TDP-43)의 집계는 ALS와 FTD 12,13,14에 연결되어있다. 따라서 선택적으로 다른 단백질 변종으로 진단 마커 및 잠재적 치료제를 제공 할 수있는 강력한 도구가 될 수 타겟팅 할 수있는 항체와 같은 시약. 이 연구에서 우리는 그러나이 문서에서 설명 된 기술은 제자의 넓은 범위에 대해 시약의 분리에 적용해야한다, 선택적으로 ALS에 연루 TDP-43 단백질의 변형을 결합 시약을 개발에 초점을 맞추고EIN은 변종.
TDP-43의 세포질 집계 ALS 15,16,17,18,19의 병리학 적 기능으로 확인되었습니다. 그것은 세포질과 핵 15,17 사이를 이동하는 경향이 있지만, 일반적으로 TDP-43은 정상인의 모든 세포의 핵에서 발....
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프로토콜
1. 파지 생산
- 바이오 안전성 캐비닛에 모든 파지 생산 및 biopanning 프로세스를 수행합니다. 제조업체의 지침을 사용하여 biopanning 프로세스 (21 라이브러리 톰린슨 I 및 J 라이브러리 및 시트) 다른 라이브러리에서 파지 입자를 생산 (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
참고 : 우리는 사용 가능한 항체의 다양성을 높이기 위해 우리의 패닝 프로세스에서 여러 라이브러리를 사용합니다. - 간단히, OD 600까지 37 ° C에서 진탕을 함유하는 2 × YT 포함 1 % 당 200 ml의 암피실린의 100 ㎍ / ㎖의 3 대 도서관의 문화 박테리아 주식은 0.4입니다.
- 톰린슨 I와 J 라이브러리 200 ㎖ 및 시트 라이브러리의 VCSM13 도우미 파지의 8 × 10 11 200 ml의 KM13 도우미 파지의 8 × 10 (11)를 추가합니다. 흔들림없이 37 ° C에서 30 분 동안 헬퍼 파지와 라이브러리 샘플을 품어.
- 원심 분리기10 분 동안 3,000 XG에 배양하고, 0.1 % 포도당을 함유하는 2 × YT 200 ....
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결과
그림 1에서 회로도는 우리가 immunotubes를 사용하여 우리의 라이브러리에서 오프 대상 항원을 결합 파지를 제거하는 부정적인 패닝 과정을 보여줍니다. 이 공통 차단 에이전트와 미래의 면역에 문제가 될 것이 목표 비특이적 반응만한 파지이기 때문에 우리는 처음 BSA 시작했다. 다음으로, 우리는 집계 단백질 (즉, 집계 알파 - 시누 클레인에 교차 반응 것 항체, TDP-43, 아 베타 등)의 일반적인 구조와 반응성이 파지를 제거하기 위해 집계 된 알파 - 시누 클레인에 바인더를 제거했습니다. AFM 결과 파지 집계 된 알파 - 시누 클레인에 대한 부정적인 패닝의 1 라운드 (그림 2A) 구속력이되고 더 8 라운드 (그림 2B) 구속력을 보였다. 우리는 다음 음으로 건강한 사람의 뇌 균질에 존재하는 많은 항원을 결합 파지를 제거하기 위해 건강한 사람의 뇌 조직에 대해 됐어요. 그림 2C
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토론
단백질 변이는 알츠하이머병, 파킨슨병, ALS 및 FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11과 같은 많은 신경퇴행성 질환의 진행에 관여하는 것으로 나타났습니다. 이러한 다양한 단백질 변이 표적을 선택적으로 인식할 수 있는 항체의 분리는 이러한 질병을 연구, 진단 및 잠재적으로 치료하는 데 효과적인 시약이 될 수 있습니다. 이러한 변이 특이적 항체를 생성하기 위해 우리는 원자력 현미경을 활용하여 각 단계의 진행 상황을 모니터링하는 새로운 바이오패닝 공정을 개발했습니다. 유사한 음성 및 양성 바이오패닝 조합을 사용한 이전 연구에서는 올리고머 베타-아밀로이드5에 결합하는 클론이 생성되었습니다. 여기에서 우리는 인간 뇌 조직 샘플에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 선택적으로 결합하는 시약을 효율적으로 생성할 수 있음을 입증하기 위해 이러한 연구를 확장합니다. 우리는 인간 ALS 뇌 조직에 고유하게 존재하는 TDP-43 변이를 선택적으로 인식하는 형태학적 특이적 시약을 분리했습니다.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH의 연구비 지원 : R21AG042066. 우리는 화면 캡처 비디오를 만드는 그의 공헌 필립 슐츠에게 감사의 말씀을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (영국 케임브리지) | ||
| Sheets Library | MRC (영국 케임브리지) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (영국 케임브리지) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | 자극성 |
| 폴리에틸렌 글리콜 8000 | OmniPur | 6510 | 자극성 |
| 염화나트륨 | 마크론 | 7647-14-5 | |
| 인산나트륨 이염기성 | Amresco | 0404-1KG | 자극성 |
| 염화칼 | EMD | PX1405-1 | 자극성 |
| 칼륨 인산염 일염기성 | Amresco | 0781-500G | 자극성 |
| TG1 세포 | MRC(영국 케임브리지) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| 소 혈청 알부민 | Amresco | 0332-100G | |
| STEN 버퍼 | Crystalgen Inc. | ||
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | 자극성 |
| 트리에틸아민 | Sigma | T-0886 | 가연성 |
| 글리세롤 | Amresco | 0854-1L | 자극제 |
| DNA 플라스미드 준비 키트 | qiagen | 27106 | 자극성 |
| 무지방 분유 카 | 네이션 | ||
| 96-웰 고 결합 ELISA 플레이트 | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Biorad | 162-0115 | 가연성 |
| 원심분리기 | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa 원자력 현미경 | Veeco | ||
| AFM 프로브 | VistaProbes | T300R-10 |
참고문헌
- Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
- Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R.
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재인쇄 및 허가
