여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜의 목표는 섬유 조직에서 그라데이션을 가진 나노 섬유 스캐폴드를 생성하는 간단한 방법을 보고하고 세포 형태/방향을 제어하는 데 가능한 응용 프로그램을 테스트하는 것입니다. 나노 섬유 조직은 골격에서 섬유 조직의 점진적인 감소를 가능하게하는 새로운 제조 장치로 제어됩니다. 섬유의 정렬을 변경하는 것은 일축 정렬된 섬유 매트에서 무작위 전기 방사 섬유의 증착 시간을 줄임으로써 이루어집니다. 섬유 증착과 동일한 축을 따라 수집기를 움직이는 장벽/마스크로 덮음으로써 조직 구조를 쉽게 제어할 수 있습니다. 조직 공학 목적을 위해 지방 유래 줄기 세포를 이러한 골격에 파종할 수 있습니다. 줄기세포는 다양한 조직 구조에서 자신의 위치에 따라 형태학적 변화를 겪으며, 위치에 따라 다른 세포 유형으로 분화될 수 있습니다. 또한, 섬유의 등급화된 조직은 나노섬유 골격의 생체 모방을 향상시켜 기존 골격에 비해 힘줄에서 뼈까지의 삽입 부위에서 콜라겐 나노섬유의 자연스러운 방향과 더 밀접하게 유사합니다. 나노 캡슐화를 통해 그라데이션된 섬유는 섬유 스캐폴드에서 화학적 구배를 구성할 수 있는 가능성을 제공하며, 이에 따라 세포-물질 상호 작용 및 계면 조직 재생의 빠른 스크리닝에서 잠재적인 응용 분야를 더욱 강화할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 연속 구배 스캐폴드를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 이동 장벽/마스크의 움직임을 개별 방식으로 제어하여 개별 단계로 섬유를 생성할 수도 있습니다.
서론
나노 섬유는 때문에 구조와 상대적 크기 1의 세포 외 기질을 모방 할 수있는 능력의 조직 공학에 대한 인기 유틸리티입니다. 그러나, 이러한 힘줄 투 뼈 삽입 부위의 조직 일부 원시 인터페이스, 힘줄을 향해 정렬 증가 뼈 사이트 2-5로 감소 변수 조직 구조를 나타낸다 콜라겐 섬유를 함유한다. 따라서, 효과적인 조직 재생이 효과적으로 구조 구배를 모방 할 수 지지체를 제조 할 필요가있다.
섬유 조성물의 점진적인 변화를 실시 이전 연구되고있다, 즉, 미네랄 함량 6. 그러나, 결합 조직의 구조 부품을 다시하면 크게 비경 남아있다. 이전 연구는 쥐의 두 개관 골 모세포의 증식 표면 실리카 입자 밀도의 효과를 연구함으로써 형태학 그라디언트 검사하고 인버 발견실리카 입자 밀도, 세포 증식 (7) 사이 SE 관계. 그러나 이전의 연구에서 세포 증식을 매개 형태 학적 변화는 섬유 조직 변경 7, 8을 흉내 낸의 능력을 결여 표면 거칠기에 주로 관련이 있었다. 최근의 한 연구는 9 전기 방사에 대한 새로운 컬렉터를 사용하여 고유의 콜라겐 섬유 방향을 모방 발판을 제작하려고했습니다. 이 연구는 모두 정렬 랜덤 섬유와 발판을 생산하는 데 성공하지만, 네이티브 조직에 전시 점진적인 변화를 모방하는 데 실패했습니다. 또한, 임의의 방향에 정렬에서 즉각적인 변화, 별도의 부품을 생산,이 지지체의 생체 역학적 특성은 유의하게 감소 하였다. 아니 이전의 작품은 정렬 된 임의의 섬유 방향에 연속 계조로 적용 나노 섬유 지지체를 생산할 수 없었다. 우리의 최근의 연구는 나노 섬유 지지체의 성공적인 휴양을 보여 주었다잠재적 건 - 투 - 뼈 삽입 (10)에서 네이티브 콜라겐 조직을 모방 할 수 섬유 조직의 계조와. 이 작업은 밀접 네이티브 힘줄 투 뼈 조직 인터페이스에서 섬유 조직이 유사한 구조를 갖는 나노 섬유 지지체의 제조에 사용되는 프로토콜을 제공하는 것을 목적으로한다.
그라데이션 나노 섬유 구조는 잠재적으로 다양한 분야에서 응용 프로그램을 광범위한했다. 우리는 이미 다양한 기판 11-14 조직 재생을 위해 사용된다 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs) 우리의 발판을 결합하여 건 - 투 - 뼈 삽입 부위의 조직 공학에 응용 프로그램에 초점을 맞추었다. 또한, 다 능성 ADSCs는 측면에서 골수 줄기 세포를 본질적으로 매우 유사하며, 이들 자원은 지방 흡입 간단한 절차 (15, 16)를 사용하여 수거 할 수있는 풍부하다. 더 계조 나노 섬유 지지체에 이들 세포를 심는 것은 자신의 TIS을 향상잠재적으로 다양한 조직으로 분화 할 수있는 세포의 제어 배포 허용함으로써 엔지니어링 응용 프로그램을 고소. 줄기 세포를 시딩 외에 나노 파이버는 세포 반응의 조절에 신호 분자로 캡슐화 될 수있다. 이러한 비계의 조직 그라데이션 nanoencapsulation 커플 링은 세포 행동이나 가능한 임플란트 디자인과 코팅의 연구 수 있습니다. 조골 세포 분화를 유도 15,16 도시 된 뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP2), 작용 성 분자의 캡슐화는 또한 이들 지지체 (10)의 조직 공학 응용 프로그램을 향상 할 수있다.
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프로토콜
해결 방법 1. 준비
- 100 ㎎ / ㎖의 대략적인 농도 폴리 (ε 카프로 락톤) (PCL) (w M = 80,000g / 몰)의 용액을 준비합니다. (4)의 비율로 디클로로 메탄 (DCM)과 N, N-dimethlyformamide (DMF)의 혼합물에 녹이고 PCL : 1 (v / v)로 10 %의 농도를 갖는 (W / V).
- 혼합하는 20 ㎖ 유리 튜브에서 용액을 놓는다. 30 분 동안 초음파 세척기에 유리 튜브를 배치, 또는 솔루션은 반투명 때까지.
2. 장치 준비
- 부착 된 21 게이지 무딘 바늘로 5 ML의 주사기에 준비 PCL 솔루션을 추가합니다.
- 그림 1 항에있어서, 수직 전기 방사 위치에 주사기 펌프를 놓습니다.
- 2cm x를 정렬 섬유 기판 5cm의 열린 공간을 스테인리스 갭 수집기를 사용합니다. 컬렉터에게 바늘 끝에서 12cm를 놓습니다.
- 에 직류 (DC) 고전압 전원을 접속바늘과 콜렉터 접지. 집이 개별적으로 다른 실험실 장비없이 연락처와 접지되어 있는지 확인합니다.
3. 전기 방사
- 제거 할 때 바늘 끝에서 형성 방울까지 1.50 ㎖ / 시간으로 설정 주사기 펌프는 즉시 대체됩니다. 그런 다음, 0.50 ㎖ / 시간에 유량을 설정합니다.
- 12 kV의에 전압 연산자를 돌립니다.
- Electrospin는 일축 정렬 섬유는 완전히 집에 격차를 커버 할 때까지.
- 작은 유리판의 가장자리에 접착제를 적용하고, 유리판에 갭 수집기로부터 섬유를 옮긴다. 유리판과 같은 크기를 가지며 접지 된 알루미늄 호일 조각 위에 유리판을 놓고.
- 그림 3에 따른 제 2 주사기 수집기를 배치합니다.
- 집 위의 두 번째 주사기 펌프 및 위치는 2 mm의 플라스틱 마스크를 연결합니다.
- (W / W) PCL 솔루션의 경우 할머니 1 %에서 쿠마린 추가 6oencapsulation는 desired-하고, 용액이 투명해질 때까지 혼합한다.
- 무딘 21 게이지 바늘로 5 ml의 바늘에 PCL 또는 PCL / 쿠마린 (6) 솔루션을로드합니다. 0.50 ㎖ / 시간으로 수직 펌프를 설정하고 9 ㎖ / 시간 또는 1mm / 분의 대략적인 속도로 당길 수평.
- 마스크까지 Electrospin 콜렉터 거의 완전히 떨어져 이동하지만, 아직 마스크 엣지 영역으로하고있다.
4. 섬유 특성
- 40mA에서 스퍼터 코터를 이용하여 40 초 동안 백금과 금속 스터드와 코트에 양면 전도성 테이프와 장소 샘플.
- 우리의 이전 연구 17, 18에 따른 주 사형 전자 현미경 (SEM)을 통해 섬유를 조사한다.
- 15 kV로의 가속 전압에서 이미지를 수집합니다.
- 섬유 배향을 측정하는 별도의 섬유 샘플을 고속 푸리에 변환 (FFT) 분석을 수행한다. FFT에 의한 측정 섬유 정렬에 대한 자세한 내용은 t 참조 할 수 있습니다이전의 연구 (19, 20) 오.
5. 시드 줄기 세포.
- 2 시간 동안 70 % 에탄올 용액에 담가 섬유 샘플을 소독. 그런 다음, 오염물을 제거하고 증류수로 세척 섬유.
- 95 % 공기 / 5 % CO 2의 분위기에 37 ° C에서 25cm 2 플라스크에 인간 ADSCs과 문화 세포를 얻습니다. 세포 배양 배지를 매일 10을 변경합니다.
- 세포를 Trypsinize 세포의 개수를 카운트. 구체적으로, 세포 배양 플라스크에서 모든 배지를 제거하고 인산 완충 식염수 회 (PBS)으로 세포를 세척 하였다. 그런 다음 세포 단층을 포함 2 ~ 3 분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플라스크를 부화 (37 ° C에 물을 욕조에 미리 따뜻한) 0.25 % 트립신 - EDTA 용액의 1m 리터를 추가합니다. 4 ml의 배지를 추가하고 모든 표면에 매체를 피펫 팅에 의해 표면에서 모든 세포를 씻어. 세포 현탁액을 원심 분리 재 분산 번째배양액 E 세포 펠릿. hemacytometer를 통해 세포를 계산합니다. 와 35mm의 - 문화 접시에 배치 된 나노 섬유 지지체에 1 × 104 세포 주위에 씨는 3, 7 일 동안 배양한다.
- 형광 다음 디 아세테이트 (아세톤 5 ㎎ / ㎖) (FDA) 이미지 형광 현미경을 이용하여 샘플을 사용하여 얼룩 세포. 구체적으로, 배양 접시에 FDA 용액 100 ㎕를 추가하고 30 분 동안 배양한다. 세 번 형광 이미징 전에 PBS로 세포를 씻으십시오. 우리의 이전 연구 (10)에 따라 사용자 정의 매트 실험실 프로그램에 의해 세포의 방향을 분석합니다.
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결과
이 프로토콜을 이용하여, 조직 그라데이션 섬유 매트를 형성 하였다.도 3은 나노 섬유 지지체상의 다양한 위치에서 찍은 SEM 이미지를 도시한다. 질적으로, 그것은 6mm (도 3d)에서 랜덤 섬유 구색 0mm (도 3A)에서 일축 정렬 된 섬유에서 진행이 있는지 판단 할 수있다. FFT는 섬유 정렬을 정량적 가치를 제공, 정량적 프로세스에 대한 세부 사항은 (19)는 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 0mm 전시 섬유 배향을 나타내고, 6mm에서 FFT 패턴은 무작위 배향을 의미 FFT에서 섬유. 점점 임의 섬유 증착 (- C 그림 3B)에 정렬 된 섬유 조직의 SEM 이미지에서 명확한 진행 (그림 3)이 있습니다.
ADSCs는 나노 섬유 지지체에서의 위치에 따라 형태 변경을 시행 하였다. 그...
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토론
프로토콜의 가장 중요한 부분은 그래디언트 스캐폴드의 생성입니다. 수집기를 덮고 있는 마스크가 일정한 속도로 움직여야 섬유 스캐폴드 내에서 점진적인 변화가 있습니다. PCL 용액의 올바른 준비도 전기 방사 성공을 보장하는 데 중요합니다. 전기방사 전에 섬유 형태를 확인하는 것이 좋으며, 특히 전기방사를 올바르게 하기 위해 더 높은 전압이 필요할 수 있는 Coumarin-6을 캡슐화한 후에는 더욱 그렇습니다.
또한, 이 프로토콜은 섬유 조직에서 이산 그라데이션을 제작할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 스캐폴드 전체에 걸쳐 다양한 두께를 생성하므로 잠재적으로 기계적 적용이 제한될 수 있습니다. 무작위 섬유 증착이 증가한 영역은 정렬된 영역보다 두꺼워집니다. 이 프로토콜은 또한 힘줄-뼈 삽입 부위에서 화학 성분의 재현으로 확장되지 않습니다. 삽입 부위에서 천연 광물 함량을 성공적으로 재현하려면 광물 구배의 구성이 필요합니다. 광물 조성 및 조직 구조의 기울기가 있는 섬유 스캐폴드의...
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공개 사항
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감사의 글
이 작품은 네브라스카 의료 센터와 국립 보건 연구소 (허가 번호 1R15 AR063901-01)의 대학에서 시작 펀드에서 부분적으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 폴리 카프로 락톤 | , 시그마 알드리치 | 440744 | |
| N, N- 디메 틀리 포름 아미드 | 피셔 화학 | D-119-1 | |
| 디클로로 메탄 | 피셔 화학 | AC61093-1000 | |
| 쿠마린 6 | 시그마 알드리치 | 546283 | |
| 지방 유래 줄기 세포, | 세포 공학 기술 | HMSC. AD-100 | |
| 소 태아 혈청 | Life Technologies | 26140-111 | |
| 플루오레세인 디아세테이트 | 시그마-알드리치 | F7378 | |
| 에탄올 | 시그마-알드리치 | E7023 | |
| 트립신-EDTA | 인비트로겐 | 25300-054 | |
| &알파;-수정된 독수리의 매체 | 인비트로겐 | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| 인산염 완충 식염수 | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| 주사기 펌프 | Fisher Scientific | 14-831-200 | 단일 주사기 |
| 초음파 세척기 | Branson | 1510 | |
| 고전압 DC 전원 공급 장치 | 감마 고전압 연구 | ES30 | |
| 주사 전자 현미경 | FEI | Nova 2300 | |
| 형광 현미경 | Zeiss | Axio Imager 2 |
참고문헌
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011(2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
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