여기에서는 소분자 조절 심장 분화와 포도당 결핍 매개 심근세포 정제를 결합하여 심혈관 질환 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 정제된 심근세포를 생산할 수 있는 인간 심근세포 유도를 위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS)은 기초 연구와 번역 애플리케이션에 사용할 수 차 심근 세포의 부족을 해결하기위한 중요한 셀 소스되고있다. 심근에 hiPSCs 차별화, 배아 체 (EB) 기반 분화 및 성장 인자 유도를 포함하는 다양한 프로토콜들이 개발되었다. 그러나, 이들 프로토콜은 비효율적 정제 심근 세포를 생성하는 능력에서 매우 다양하다. 최근의 Wnt / β-catenin의 신호의 작은 분자 기반 프로토콜을 사용하는 변조는 높은 효율로 심장 분화를 촉진 것으로 나타났다. 이 프로토콜로, 분화 된 세포의 50 % 초과 -60 % 심장 트로포 닌 양성 심근 세포가 지속적으로 관찰했다. 또 심근 순도를 증가시키기 위해, 구체적으로는 분화 세포 대사 차이에 기초하여 비 - 심근 세포를 제거하는 기아 글루코스 행 하였다심근 세포와 비 심근 세포 사이의. 이 선택 전략을 사용하여, 우리는 지속적으로 분화 된 세포의 집단에서 비 심근에 심근의 비율보다 30 % 증가를 획득. 이러한 고순도 심근 질환 체외 모델링 연구 및 약물 스크리닝 분석법 인간 IPSC 기반 결과의 신뢰성을 향상한다.
서론
차 인간 심근 인해 침습 심장 생검 및 배양 때문에 열악 장기 세포 생존의 단일 셀에 대한 해리 곤란한 요구 사항으로 얻는 것이 곤란하다. 차 인간의 심근 세포, 환자 맞춤형 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 부족을 감안할 때 (hiPSC-CM) 기술은 기초 연구에 대한 강력한 대안 심근 소스뿐만 아니라 질병 모델링 및 약물 임상 및 번역 응용 프로그램으로 간주되었습니다 발견 한. 심근 세포로 다 능성 줄기 세포를 분화 이른 노력 배양체 EBS ()을 사용하여 분화 프로토콜을 채용하지만, EB의 셀 종종으로 25 % 이상이 심근 2,3- 치기 때문에이 방법은 제조 심장 근세포에서 비효율적이다. 비교적, 및 BMP4를 티빈 사이토 카인을 사용하여 단층 계 분화 프로토콜 EB를보다 높은 효율을 표시하지만이 프로토콜은, 여전히 상대적으로 비효율적이다 인간 다 능성 줄기 세포 (4)의 제한된 수의 비싼 성장 인자, 및 전용 기능을 필요로한다. 최근 고효율 hiPSC 단층 계 심근 분화 프로토콜의 Wnt / β 카테닌 5 변조 신호에 의해 개발되었다. 이러한 hiPSC-CMS는 심장 트로포 닌 T와 알파 티닌, 심근 6의 표준 마커 두 sarcomeric 단백질을 표현한다. 프로토콜은 여기에....
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프로토콜
주 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약 벤더 정보가 표 1에 나열되어있다 및 재료 목록. 세포와 접촉하는 모든 솔루션과 장비는 멸균해야하며, 무균 기술 규격 제품을 사용한다. 달리 명시되지 않는 한 가습 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 모든 문화 배양을 수행합니다. 이 프로토콜에서, 모든 분화가되는 hiPSCs가 시딩 6- 웰 플레이트에서 수행된다. 분화 및 정제 후, 세포를 분해 할 수 있고, 다운 스트림 사용을 위해 플레이 팅.
1. 중간 준비
- E8 매체의 경우, 각 미디어 구성 요소에 대한 스톡 용액 (NaHCO3을, L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 아 셀렌 산 나트륨, 트랜스페린, 인슐린, FGF2, TGFB1)을하고 -20 ℃에서 용액을 저장한다. DMEM / F12의 병에 원액을 적당량을 추가하고 소독 필터링합니다. 솔루션 CONCENTR주식 구성 요소 및 E8 매체에 대한 ATION 반응 설정은 표 1에서 찾을 수 있습니다.
- 세포 외 매트릭스 솔루션의 경우, 4 ° CO / N에서 (일반적으로 10 ㎎ / ㎖에서 제공) 기저막 행렬을 해동. ....
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결과
hiPSC 차별화 동안 형태 학적 변화.
공급 장치가없는 접시에서 배양 hiPSC는 평면의 2 차원 식민지 증가했다. 약 85 %의 포화 상태에 도달하면, hiPSCs는 분화 (그림 1A) 6 μM 치르 처리 하였다. 세포 죽음, 정상 및 일반적인 현상은 상당량 치르 처리 24 시간 후에 관찰 하였다. 치르 처리 이틀 후, hiPSCs는 중배엽 운명 향해 분화하는 것을 계속했다. hiPSC 식민지에서 세포와 비교할 때 이러한 일이 세포에 대한 세포의 크기가 증가했다. 세포 수는 세포 분열 (그림 1B)를 통해 증가했다. 5 일째, 중배엽 세포 계보 심장 (심장 중배엽)을 지향 하였다. 이 때, 세포 유착과 특성, 가지 같은 구조 (그림 1C)을 형성하기 시작. 10 일에, 지사와 같은 구조는 매우 발음 및 심근 스타했다테드는 자발적으로 (그림.......
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토론
고순도 hiPSC 유래 심근 세포를 다량 획득하는 기본 심장 연구뿐 아니라 임상 및 병진 애플리케이션에 중요하다. 심장 분화 프로토콜은 작은 분자 변조 및 단층 기반의 방법 (5)에 마지막으로 심인성 성장을 이용하여 배아 몸 기반 방식에서 전환, 최근 몇 년 동안 엄청난 개선을 시행 샌드위치 방법 (12) - 매트릭스, 2 인자하고있다. 전술 한 프로토콜, 여기에서 설명한 프로토콜은 최고 및 소분자 치르 및 IWR 5,7-을 사용의 Wnt / β 카테닌 신호를 변조함으로써 hiPSC 상이한 세포주에 대한 가장 재현성 심장 분화 효율 표시. 특히, 미분화 hiPSCs는 Wnt 신호 억제제 IWR1와 GSK3 베타 억제제 치르 이후 심장 차별화 중배엽 차별화를 받아야하도록 유도했다. 이러한 순차적 인 단계Wnt 신호 변조, 심장 계통의 유도 단계에서 인슐린 결핍에 힘 입어, 고효율의 심장 분화되었다. 치르가 중배엽 유도에 사용되는 공통의 소분자 GSK3.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이해관계를 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH/NHBI(U01 HL099776-5), NIH Director's New Innovator Award(DP2 OD004411-2), California Institute of Regenerative Medicine(RB3-05129), American Heart Association(14GRNT18630016) 및 Lucile Packard Foundation for Children 및 Stanford의 Child Health Research Institute(SMW)에서 수여하는 Endowed Faculty Scholar Award의 지원을 받았습니다. 또한 미국심장협회(American Heart Association)의 박사전 펠로우십 13PRE15770000 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십 프로그램 DGE-114747(AS)의 자금 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI 배지 | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI 배지 | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| 소 태아 혈청 | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK 억제제 Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| 극저온 | 피셔(NUNC 튜브) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
참고문헌
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).
- Kehat, I., et al.
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재인쇄 및 허가
