방법 논문

의 동기화 Caulobacter Crescentus 세균 세포주기의 조사에 대한

DOI:

10.3791/52633

⸱

2015년 4월 8일

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

이 논문에서

요약

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박테리아 세포의 동기화는 박테리아 세포주기와 발달에 대한 연구에 필수적입니다. Caulobacter crescentus는 밀도 원심분리를 통해 동기화가 가능하여 박테리아 세포주기 연구를 위한 빠르고 강력한 도구를 제공합니다. 여기에서는 Caulobacter 세포의 동기화를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

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세포주기는 모든 세포의 성장, 게놈 복제 및 발달에 중요합니다. 박테리아의 경우, 세포주기에 대한 연구는 주로 동기화되지 않은 세포에 초점을 맞추고 있어 세포주기 진행, 게놈 복제 및 분열에 필요한 시간적 사건을 정렬하기가 어렵습니다. Caulobacter crescentus는 밀도 원심분리를 통해 세포가 G0 상태에서 빠르게 동기화될 수 있는 박테리아 세포 주기에 대한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 세포주기 동기화 실험은 염색체 복제 및 분리를 관장하는 분자 이벤트를 확립하고, 세포주기 진행을 제어하는 유전자 조절 네트워크를 매핑하고, 비대칭 세포 분열에 필요한 극성 신호 복합체의 설정을 확인하는 데 사용되었습니다. 여기에서는 Caulobacter NA1000 세포의 빠른 동기화를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 동기화는 유전자 발현 프로파일링 및 웨스턴 블롯 분석을 위한 대규모 형식뿐만 아니라 현미경 또는 FACS 분석을 위한 소규모 형식으로 수행할 수 있습니다. Caulobacter의 빠른 동기화성과 높은 세포 수율로 인해 이 유기체는 박테리아 세포주기 연구를 위한 강력한 모델 시스템이 됩니다.

서론

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박테리아 세포 사이클은 게놈의 복제와 딸 세포 분열의 양을 제어한다. 항생제 내성은 공중 보건에 대한 위협도 갈수록 증가로 중요한 것은, 세균 세포주기 항생제 개발을위한 미개척 목표를 제시한다.

세균 Caulobacter crescentus의, 각 셀은 서로 다른주기 운명 (도 1a)의 1,2- 개의 딸 세포를 수득 비대칭 분할 리드. 한 딸 셀은 편모를 상속하고 다른 딸이 줄기를 상속 고착 동안 운동성이있다. 통합 유전자 회로는 전사 조절, 인산화 신호 전달 및 조절 단백질 분해 (3)에 의한 세포주기 진행과 세포의 운명을 제어합니다. 또한, 염색체 복제 및 동시 분리 수율 딸 세포는 염색체 4의 단 하나의 복사본을 포함하고있다. 중요한 것은, 이러한 두 가지 종류의 세포는 급속 collo 의해 분리 될 수있다높은 수율 (도 1b)와 인구의 나머지 swarmer 세포의 분리를 허용하는 동기화 가능한 균주의 NA1000 5-7 idal 실리카 입자 밀도 원심. 세포 swarmer 절연 한 후 비대칭 세포 분열을 통해 동 기적으로 진행합니다. 여기서 우리는 세부 프로토콜은 Caulobacter 변형 NA1000를 동기화에 사용됩니다. 우리는 프로토콜과의 크고 작은 규모 모두 동기화에 대한 일반적인 문제 해결 팁을 제공합니다. 이 실험 절차는 Caulobacter의 세포주기 및 세포 운명의 시공간 제어를 심문 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

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1. 대규모의 Synchrony - 웨스턴 블롯 (Western Blot), 마이크로 어레이 / RNA-SEQ 및 기타 재료 집중 분석 실험을위한 최적

  1. 냉동 주식이나 접시에서 PYE 매체에서 28 ° C에서 흔들어 변형 NA1000의 5 ML의 O / N 문화를 성장.
  2. M2G 25 ㎖ (표 1-2)에서 1 단계의 세포 0.5 ㎖를 접종하고, 문화는 0.5과 0.6 사이의 OD (600)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 흔들.
  3. M2G 1 L로 세포를 접종하고 28 ° C에서 흔들.
  4. OD 600 0.6 0.5에 도달하면, 액체 장착 위상 현미경을 사용하여 세포 swarmer의 존재를 확인한다. 위상 현미경 유리 슬라이드에 세포의 1 μL가, 커버 슬립 커버 스팟 및 이미지. 인구 급속 수영 세포를 시각화하여 swarmer 세포의 존재를 확인한다.
  5. JA-10 회에서 4 ° C에서 7 kxg에서 15 분 동안 세포를 스핀.
  6. 뜨는을 취소하고 차가운 M2의 180 ml에 추가 (표 1-2)와 부드럽게 입술혈청 학적 피펫을 사용하여 모든 세포 uspend. 느슨하게 펠렛 세포를 폐기; 그들은 predivisional 및 스토킹 세포이다.
  7. 차가운 콜로 이달 실리카 용액 60ml를 추가하고 잘 세포 현탁액을 혼합 (물론 셀에 추가하기 전에 콜로 이달 실리카 현탁액을 혼합해야합니다).
  8. 여덟 30 ml의 튜브에 세포 현탁액을 붓고 JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 30 분 동안 회전.
    참고 : 하나는 두 가지 밴드를 참조한다 스토킹 / predivisional 세포 TOP 밴드 (도 1b)에있는 동안 swarmer 대역 하위 밴드이다.
  9. 조심스럽게 꺼 상단 밴드를 대기음 swarmer 밴드 (낮은 밴드) 위 ~ 1cm로 액체를 제거합니다.
  10. 파스퇴르 피펫을 사용하여 (긴급),주의 깊게 swarmer 밴드를 제거하고 깨끗한 튜브에 배치합니다. JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 10 분 동안 콜로 이달 실리카, 최고 추위 M2와 튜브 오프 스핀을 씻어합니다.
  11. 조심스럽게 상층 액을 제거하고를 재현 탁20 차가운 M2 ml의 JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 10 분 동안 스핀 세포.
  12. 감기 M2의 30 ㎖ 중에 모든 펠릿을 재현 탁하고, 분광 광도계를 사용하여 OD (600)을 측정하고 차가운 M2 매체를 이용하여 빈. 세포 swarmer 확인하기 위해 위상 영상 1 μl를 저장; 세포 90-95 %가 swarmers해야한다.
  13. JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운. 28 ° C M2G 매체에 재현 탁 세포 600 ~ 0.3-0.4, 28 ℃에서 진탕 시작되도록.
    참고 : 일반적인 수익률은 30 동기화되지 않은 세포의 1L에서 swarmer 세포 배양의 60ML 사이.
  14. 시점 (야생형 문화를 나누는 약 135-140분 소요됩니다) 8,9를 복용 시작합니다. 각 시점에서, OD (600)을 측정한다. 분할 후 OD (600)는 약 2 배의 초기 OD 600 있는지 확인합니다.
  15. 웨스턴 블롯 또는 유전자 발현 분석을 위해, 용돈의 1 ㎖ 씩 제거원하는 시점에 lture는, 빠르게, 30 초 동안 탁상 원심 분리기에서 최대 속도로 스핀 다운 가만히 따르다 또는 매체를 대기음, 플래시는 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결. 다운 스트림 분석 할 때까지 -80 ° C에서 세포를 저장합니다.

2. 작은 규모의 Synchrony - 현미경을위한 최적

  1. 냉동 주식이나 접시에서 5 ML의 O / N 문화 M2G 28 ° C에서 진탕 성장한다.
  2. M2G 15 ㎖ (표 1-2)에 희석 중반 로그 (OD = 0.5 ~ 0.6 600)까지 성장한다.
  3. 1 ml의 차가운 M2 (표 1-2)과 2 ML의 microcentrifuge 관에 전송에서 JA-20 회에서 4 ° C에서 10 분 6.4 kxg에 스핀, 그리고에 resuspend.
  4. 뜨는을 대기음, 펠릿 세포 microcentrifuge 관에서 3 분 15 kxg에 스핀, 감기 M2의 900 μL에 얼음에 펠릿 및 재현 탁했습니다.
  5. 마이크에서 4 ° C에서 15 kxg에서 20 분 동안 콜로 이달 실리카 스핀 코팅 감기 PVP의 900 μl를 추가rocentrifuge 튜브.
  6. (긴급) 대기음은 최고에게 스토킹 / predivisional 세포 밴드를 피펫하고 새로운 microcentrifuge 관에 밴드 swarmer 바닥을 수집하거나.
  7. 3 분 15 kxg에서 원심 분리 동안 감기 M2의 1 ml의 swarmer 세포를 두 번 씻으십시오.
  8. 최종 스핀 앞서, 냉장 1ml의 유리 시험관에 세포 이동 및 M2의 블랭크에 비해 셀 OD (600)을 측정한다.
  9. 0.3 사이의 OD에서 28 ° C M2G에 최종 세포 펠렛을 재현 탁 - 0.4, 28 ℃에서 / 롤 세포를 흔들어.
    참고 : 일반적인 수익률이 swarmer 세포 배양의 2 내지 4 ml의입니다.
  10. 이미징을위한 M2G 아가로 오스 패드 상에 세포의 원하는 시점 장소 1 μL에서 현미경 실험하십시오.

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결과

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높은 밀도가 swarmer 밴드, 낮은 밀도의 스토킹 / predivisional 세포 밴드 : 동기화는 일반적으로 세포의 두 밴드 (그림 1B)를 산출한다. 효율적인 동기화 공통 컨트롤 OD 600를 모니터링하고 뚜렷한 세포주기 시점에서 웨스턴 블롯 CTRA 단백질의 수준을 측정 포함되도록한다. OD (600)는 세포주기의 과정 (도 2) 동안 약 2 배 증가한다. 세포주기 마스터 레귤레이터 CTRA 대한 웨스턴 블롯 좋은 공시성 (도 2)을 확인하는 유용한 제어이다. CTRA은 DNA 복제를 차단하는 swarmer 셀에서 이용되고, DNA 복제 (10)의 개시시에 열화된다. CTRA는 나중에 세포주기에서 합성 한 11,12 및 편모의 많은 구성 요소들을 포함하는 유전자의 발달 숙주의 전사를 활성화한다. 성공적인 동시성은 t을해야합니다CTRA 단백질 수준 그...

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토론

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박테리아 세포 주기는 생명의 기본 과정이며 성장 연구와 차세대 항생제의 표적으로 중요합니다. 여기에서는 박테리아 세포 주기 및 비대칭 세포 분열 연구를 위한 모델 유기체인 C. crescentus NA1000에 대한 신속한 동기화 절차를 자세히 설명했습니다. 이 방법은 박테리아 세포 주기의 시공간 조절을 조사하기 위해 웨스턴 블롯, 유전자 발현 프로파일링 및 형광 현미경 분석으로 수정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 빠르고 건강한 동기화된 세포를 생성합니다. 다른 동기화 방법은 세포의 긴 기아를 필요로 하고 동일한 상태에서 세포 주기를 정지시키기 위해 엄격한 반응에 의존하여 로그 성장에서 배양과 다른 세포를 초래합니다 13. "베이비 머신" 및 기타 표면 부착 방법이 성공적으로 사용되었지만14,15, 일반적으로 동기화된 세포의 수율이 낮습니다. 여기에 제시된 밀도 원심분리 프로토콜은 동기화된 C...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 원고에 대한 의견을 제시한 Shapiro 연구실 구성원과 Erin Schrader에게 감사를 표합니다. 저자는 NIH 박사후 연구원 F32 GM100732 JMS와 NIH 보조금 R01 GM51426 및 R01 GM32506 LS의 재정적 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PVP 코팅 콜로이드 실리카(Percoll)Sigma-AldrichP4937
콜로이드 실리카(Ludox AS-40)Sigma-Aldrich420840
JA10 로터Beckman-Coulter369687
JA20 로터Beckman-Coulter334831
황산철 킬레이트 용액Sigma-AldrichF0518
30 ml 원심분리기 튜브Corning8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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