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방법 논문

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7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52636

⸱

2015년 3월 13일

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

이 논문에서

요약

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다. 이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

초록

Drosophila melanogaster oogenesis는 난소가 구조적으로 비교적 단순하고 특성화가 잘 되어 있으며 유전자 분석이 가능하기 때문에 다양한 발달 과정을 연구하는 데 이상적인 맥락을 제공합니다. 각 난실은 체세포 여포 세포의 단일 상피층으로 둘러싸인 생식계 세포로 구성됩니다. 여포 세포의 부분 집합은 특정 단계에서 분화를 거쳐 여러 가지 다른 세포 유형이 됩니다. 표준 기술은 주로 난실에 대한 측면 보기를 허용하므로 여포 세포 조직 및 정체성에 대한 제한된 관점을 허용합니다. 정립 이미징 프로토콜은 표준 컨포칼 현미경으로 난실을 수직으로 볼 수 있는 장착 기술을 설명합니다. 샘플은 먼저 유리 현미경 슬라이드의 측면(수평) 위치에 있는 두 층의 글리세린 젤리 사이에 장착됩니다. 그런 다음 계란 챔버가 들어있는 젤리를 블록으로 자르고 커버 슬립으로 옮기고 뒤집어 계란 챔버를 똑바로 세웁니다. 장착된 난실 챔버는 정립 또는 도립 컨포칼 현미경으로 이미지화할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여포 세포 사양, 조직, 분자 마커 및 난자 발달을 새로운 세부 사항과 새로운 관점에서 연구할 수 있습니다.

서론

초파리의 연구 현상의 넓은 범위의 유전자 조절에 큰 통찰력을 제공하고 있습니다. oogenesis 티슈 패터닝 셀 극성의 변화, 세포주기 스위칭, 및 병진 규제 1,2,3,4- 등 다양한 발달 과정을 조사하기 취급 용이 한 방법을 제공하기 때문에 특히, 계란 개발에 대한 광범위한 연구가있어왔다. oogenesis 때 중요한 형태 발생 이벤트 (5 검토) 테두리 세포라는 세포의 집합의 명세서, 운동성의 취득 및 마이그레이션이다. 세포 이동하기 때문에 동물 형태 발생의 중요한 특징이며,이 프로세스의 유전자 조절이 잘 보존되어 있기 때문에, 파리 결정 메커니즘은 다른 상황에서 중요 할 것으로 보인다. 따라서, 우리는 경계 세포 이동의 분자 제어를 조사하고있다. 우리의 연구를 위해, 우리는 계란을 개발하는 전방 극을 관찰 할 수있는 새로운 방법을 개발했다,경계 셀이 발생하는 경우, 그들이 어떻게 발달 상세히 검토한다.

난소 내에서 다양한 발달 단계에서 계란 챔버는 얇은 외피 (그림 1A)에 싸여있다 ovarioles라는 체인을 따라 존재한다. 각 달걀 챔버는 한 계란을 형성에 갈 것입니다. oogenesis 동안 여러 종류의 세포 조화롭게 개발해야한다. D. 달걀 melanogaster의 챔버는 단일 모낭 상피 층 (6)에 의해 둘러싸인 하나의 난자를 포함한 16 생식계 세포로 구성된다. 극성 세포라는 특수한하는 소수의 세포는 상피의 전후방 극에서 발생한다. 6-8 테두리 세포 극성 세포에 의해 유도 된 5,7- 달걀 챔버의 전방 상피에서 발생. 중간 oogenesis (단계 9)에서, 경계 셀들이 이웃으로부터 분리하고 계란 5,7- 챔버의 후방에 도달하는 난자 세포 간호사 사이에 이동한다. 이 운동은 달성해야테두리 세포 집단이 세포 이동의 유형 만드는 두 운동성 극성 주변 세포 클러스터에 남아있다. 경계 셀 클러스터의 성공적인 마이그레이션 수정에 필요한 달걀 껍질의 micropyle의 적절한 개발을 보장합니다.

전방 극성 세포 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 경계 셀 운명 지시. 폴라 난자 세포의 발달 8,9 스테이지 (8) 중에 모낭 인접 셀에, 경막 수용체 Domeless (DOME)에 결합하는 사이토킨으로 독립 (UPD)를 분비한다. UPD의 결합은 야누스 티로신 키나제 (JAK)의 전사 (STAT) 8,10,11의 신호 변환기 및 활성제를 인산화됩니다. STAT는 전사를 활성화하기 위해 핵으로 이동합니다. 느린 테두리 세포 (SLBO)는 STAT의 직접 전사 대상이며, 또한 테두리 세포 이동 (12)에 요구되는 전사 인자이다. 계란 챔버의 측면보기는 t을 나타냅니다모자 STAT 활동은 전방 상피 8,11,13에 걸쳐 그라데이션으로 조절된다. 극성 세포에 가장 가까운 여포 세포 따라서 그들이 경계 셀과 인접되어 생식계 조직 침입, STAT 활성화의 가장 높은 수준을 갖는다.

국경 세포 내에서 지정 및 상피 세포에서 분리하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 조직이 어떻게 구성되어 있는지 관찰해야합니다. 우리가 전방-에 관점에서 계란 챔버를 보면, 우리는 극성 세포를 둘러싸고있는 여포 세포에서 STAT 활동의 반경 대칭을 기대. 최종에서보기는 더 정확하게 이전에 다른 초점면에 세포를 비교하는 것보다 분리하는 동안 막 단백질과 세포 - 세포 인터페이스의 차이를 보여 것입니다. 달걀 챔버 직사각형과 줄기 세포에 의해 서로 연결되어 있기 때문에 어려운 전방 구조를 관찰하기 위해, 측 방향 슬라이드 상에 정착. 따라서, 달걀 챔버의 극의 세포에 대한 많은 정보가 있습니다측면 뷰에서 유추 된. 일부 정보는 photobleaching에 광학 부, 광 산란의 알고리즘 3-D 재구성 및 Z 축에서의 해상도 불량한 한계를 통해 얻어 질 수 있지만, 초 - 해상도 현미경 (14)과 같은 고가의 기술이없는 경우에이 정보는 이하 상세하고 신뢰성을 . 섹션 기반 이미징의 다른 종류 (예를 들어, 전자 현미경 또는 마이크로톰 절편)는 아티팩트 가능성을 증가, 탈수 포함한 조직의 광범위한 조작을 필요로한다. 따라서, 우리는 이미지 D.에 새로운 방법을 개발 똑바로 동안 melanogaster의 달걀 챔버. 이 방법은 이미 (검토중인 대표 결과와 매닝 등을 참조) 운동성이있는 세포가 운명하는 방법을 아는데 도움이 검증 된, 그리고 더 넓게 가치 oogenesis의 다른 측면의 연구 될 가능성이있다.

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프로토콜

Ovarioles 1. 해부

  1. 추가 활성 건조 효모와 신선한 플라이 식품 유리 병에 약 15 ~ 4 일 된 여성 파리와 몇 명의 남성을 전송합니다. 바이알을위한 마개로 솜을 사용하여, 높은 습도를 유지하는면에 몇 방울의 물을 추가한다.
  2. 14-16 시간 동안 25 ° C의 배양기에서 찾는 바이알 스테이지 8-10 달걀 챔버의 개수를 최대화한다.
    참고 : 배양 시간은 온도와 원하는 단계에 따라 달라집니다.
  3. 다음날에 필요한 해부 미디어를 준비, 0.1M KPO 4 NP40 솔루션 (자료 참조).
  4. CO 2를 사용하여 파리를 마취하고, 해부 현미경으로 배치합니다. 피펫 유리 우울증 슬라이드의 각 공동으로 해부 미디어를 몇 방울.
  5. 한 여성 비행 아래로 날개를 가진 테이블 상단과 동양에 약 30 ° 각도로 각 손에 집게를 잡습니다. 당신의 비 지배적 인 손으로, 그녀를 잡고, 집게를 사용하여 여성을 데리러흉부 근처 복부의 nterior 및 우울증 슬라이드 (그림 1A 인세 트)의 해부 미디어에 그녀의 잠수함.
  6. 포셉의 다른 쌍으로, 복부의 복부 후방에서 외골격을 잡고 관통. 후방 끝에 난소를 잡고, 다음 복부에서 그들을 끌어와 우울증 슬라이드의 반대편에 신선한 미디어에 배치합니다. (그림 1A 인세 트). 장 떨어져 당겨하지 마십시오. 시체를 버리십시오.
  7. 모든 난소를 해부 할 때까지 다른 여성 파리로 반복합니다. 남성을 폐기하십시오.
  8. 포셉 한 쌍, (가장 큰 달걀 챔버 근처) 후방 끝에 난소를 잡고 다른 손으로 가장 앞쪽에 계란 챔버 (germarium) 중 하나를 꼬집어 집게 한 쌍을 사용합니다. (도 1a).
  9. 천천히 그리고 꾸준히, 난소 칼집에서 ovariole 체인을 당깁니다. 원하는 모든 계란 챔버 R 때까지 개별적으로 ovarioles를 해부 계속emoved.
  10. 반복하여 모든 해부 난소에 대한 1.7-1.8 단계를 반복합니다.
  11. 완료되면, 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 0.6ml 튜브에 ovarioles를 전송할 수 있습니다.
  12. ovarioles는, 튜브의 바닥에 정착 한 후 고정 및 염색 단계로 진행하자.

Ovarioles 2. 면역 형광 (IF) 염색

  1. 조심스럽게 피펫 ovarioles에서 해부 용지를 제거합니다. 어떤 ovarioles 또는 달걀 챔버를 제거하지 마십시오. ovarioles 및 해부 미디어의 약 50 μl를 남겨주세요.
  2. 튜브에 0.1 M KPO 4 버퍼의 150 μl의 16 % 파라 포름 알데히드의 50 μl를 추가하고이를 해결하기 위해 계란 챔버에 솔루션을 추가합니다. 10 분 동안 흔들 동안 품어. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다.
  3. 정착액을 제거하고 0.5 ml의 NP40 세척 버퍼로 두 번 씻어.
  4. RT에서 15 분 각각 두 번 씻으십시오.
  5. 다음 단계에 대한 표준 IF 프로토콜 15을 참조하십시오.
    1. 간단히, 고정 후, 추가적절한 희석에 차 항체와 4 ° C에서 O / N을 품어. (200 희석 1) 다음 이차 항체를 추가, NP40 여러 번에 씻으십시오.
    2. NP40에서 여러 번 세척 한 후 DAPI (1 : 1,000)를 추가 10 분 동안, 다음 세척을 반복합니다. 프로토콜이 완료되면 일단, 계란 챔버에 PBS에 50 % 글리세롤 200 μl를 추가하고 2 시간 동안 실온에서 앉아 보자.
    3. , 용액을 제거 PBS에 70 % 글리세롤로 교체하고, 호일 커버. 설치 준비가 될 때까지 4 ᵒC에서 샘플을 놓습니다. 한편, 3 단계를 계속합니다.

글리세린 젤리 슬라이드 3. 사전 준비

  1. 글리세린 젤리 주걱을 이용하여 적어도 4 mL로 측정하고 반쯤 마크에 유리 셀 배양 관을 채운다. 30 분 동안 55 ℃에서 수욕 글리세린 젤리 녹아.
  2. 두 현미경 슬라이드 상 스톡 용액으로부터 글리세롤의 작은 방울, 약 300 μL를 붓는다. 조직을 사용하여 얇은 라 글리세롤 확산yer의 각 슬라이드에 걸쳐. 이 기반을 제공하고 단계 5.6에서 글리세린 젤리 쉽게 제거 할 수 있습니다.
  3. 필터링 된 1,000 μL 피펫 팁 오프 끝을 잘라. 사용 컷 피펫 팁 천천히 각 현미경 슬라이드에 따뜻한 글리세린 젤리 1,000-1,500 μl를 전송합니다. 거품을 방지하기 위해 필요한주의를 기울입니다.
  4. 글리세린 젤리 슬라이드 설정 실온에서 5 분 동안 앉아 보자.
  5. 60mm × 15mm 페트리 접시에 각각의 글리세린 젤리 슬라이드를 삽입하고 플라스틱 포장으로 덮고. 4 ° CO / N에서 장소. 선택적으로, 상점은 4 ° C에서 최대 5 일 동안 젤리 슬라이드 글리세린.

4. 계란 챔버 장착

  1. 단계 2.5, 하나의 글리세린 젤리 슬라이드에 걸쳐 70 % 글리세롤 계란 챔버의 피펫 여러 3 μL 상품에서 샘플을 사용. 모든 계란 챔버이 슬라이드 때까지 피펫 3 μL 상품을 계속합니다. 각각의 강하가 적어도 10 달걀 챔버가 포함되어 있는지 확인합니다. 한편, 55 ° C의 물을 욕조에 글리세린 젤리의 문화 튜브를 가열.
  2. 해부 현미경으로 계란 챔버와 글리세린 젤리 슬라이드를 놓습니다. 계란 챔버의 한 방울의 시야 (도 1b)에 있도록 배율을 조정한다.
  3. 원하는 단계 달걀 챔버를 데리러, 숟가락으로 30 게이지 바늘을 사용. 시 칼 등을 이용하여 바늘 ovariole 체인에서 필요한 별도 소망 달걀 챔버.
  4. 영상을 방해 할 수있는 파편을 피하기 위해, 왼쪽 (그림 1E -1)에 직면 전방에, 두 번째 글리세린 젤리 슬라이드에 계란 챔버를 전송합니다. 적어도 7 계란 챔버 열 (그림 1C)에 줄 지어있을 때까지 반복합니다.
  5. 원하는 모든 계란 챔버가 제 2 글리세린 젤리 슬라이드로 전송 될 때까지 일곱의 새 열을 형성합니다.
  6. 조직과 트위스트의 작은 조각을 떼어냅니다. 가볍게 하나 하나를 만져 계란 챔버에서 초과 PBS-글리세롤을 흡수하는 데 사용합니다. 달걀 챔버를 제거하지 않도록주의하십시오.
  7. 잘라필터링 된 200 μL 피펫 팁의 끝. 계란 챔버의 모든 열을 충당하기 위해 젤리 글리세린의 150 μl를 전송하는 데 사용합니다.
    주 : 칼럼을 커버하기 위해 필요한 글리세린 젤리의 양을 알 챔버 단계 및 열 번호에 기초한다. 사용량이 적절히 조절 될 수있다.
  8. 글리세린 젤리 상부층 완전히 (도 1D) 고화 될 때까지 장착 달걀 챔버 RT에서 5 분 방치.
  9. 장소 60mm × 15mm 페트리 접시에 장착 된 계란 챔버 슬라이드 및 플라스틱 포장으로 덮고. 4 ° CO / N 스토어는 (photobleaching에 대한 우려가있는 경우 어두운 장소) 글리세린 젤리 층이 함께 응고 허용합니다.

이미징 계란 챔버 5. 준비

  1. 해부 현미경 아래에 장착 계란 챔버의 슬라이드를 놓습니다. 계란 챔버 한 열만이 시야에 있도록 배율을 조정한다.
  2. 45 ° 각도 소형 메스를 사용하여, straig를 잘라(계란 챔버의 후방에 가까운 측) 달걀 챔버의 첫 번째 열의 우측에 HT 라인. (그림 1D-E)
  3. 다음에, 열의 마지막 달걀 챔버 맨 먼저 계란 챔버의 상하 절단. 이 시점에서 달걀 챔버 열 삼면 절단 예정.
  4. 계란 챔버 (도 1E -3)의 전방 측에 최대한 가깝게 microknife 열의 왼쪽의 슬라이스를 이용.
  5. 절단 된 열을 통해 감기 1X PBT 100 μl를 피펫.
  6. 슬라이드에 나머지를 떠나, 계란 챔버 및 폐기의 절단 열 세 가지 측면 주위에 여분의 글리세린 젤리를 제거하기 위해 둥근 가장자리 주걱을 사용합니다.
  7. 계란 챔버의 전방 측에 만든 컷 주걱을 삽입하고 기본 글리세린 젤리 블록에서 열을 구분합니다.
  8. 샘플 중 하나를 반전 (5.8.1) 또는 수직 (5.8.2) 현미경을 준비합니다.
    1. 거꾸로 현미경의 경우 : 전송 t계란 챔버의 앞쪽면이 아래로 향하게하여 커버 슬립에 계란 챔버 그는 열입니다. 글리세린 젤리의 모든 열 제거 및 장착 될 때까지 반복 5.2-5.8 단계를 반복합니다. 마르지 않도록 달걀 챔버의 각 블록에 50 % PBS-글리세롤의 몇 방울을 추가합니다. 직접 커버 슬립에 이미지 계란 챔버.
    2. 직립 현미경의 경우 : 전방면이 위로 향하게하여 현미경 슬라이드에 계란 챔버의 열을 전송합니다. 글리세린 젤리의 모든 열을 제거하고 현미경 슬라이드에 장착 될 때까지 반복 5.2-5.9 단계를 반복합니다. # 1 ½ coverslip에 계란 챔버 커버 블록의 각 블록에 50 % PBS-글리세롤의 몇 방울을 추가합니다.

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결과

똑바로 이미징 방법은 우리가 단 8시에 전방 모낭 상피 세포의 직접 조직을 볼 수 여포 세포 운명의 일반적인 마커, 눈에 결석 (EYA) 단백질뿐만 아니라 핵 DNA 마커 DAPI, 심지어 표현을 보여 주었다 세포의이 들판을 가로 질러, 모든 세포가 비슷한 염색 강도 (그림 2B ")로 볼 수 있다는 것을 보여 주었다. 사이토킨 UPD에 응답하여 조절 단백질 그러나, 가변 패턴 및 발현 수준을 보였다. 극 세포는 계란 개발 16, 17의이 단계에 치근단 이전에 UPD를 해제, 그래서 우리는 STAT 때때로 사건이었다 극성 세포에 대해 반경 방향으로 활성화 될 것으로 예상. 종종하지만, 우리는 SLBO 포함 STAT의 다운 스트림 대상, 관찰 더 복잡한 발현 패턴을 가지고 있었다. 예를 들어, SLBO 발현 GFP 기자 전부는 아니지만, 대부분의 극성 세포를 둘러싸 세포 (그림 2B 등장하고, 맨 참조ING 등 검토 중 등).

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토론

여기서 우리는 말에 관점에서 계란 챔버를 개발, 탑재하는 방법을 설명하고 이미지 작은. 영상 계란 챔버의 일반적인 기술은 측면 플레이에 최적화 된 형광 항체 염색을 할​​ 때 주로 메디 오 - 측면 모낭 세포의 정확한 시각화를 허용하고 있습니다. 여러 초점면을 볼 수있는 Z-스택 또는 3 차원 재구성 보조기구의 사용,하지만 여전히 타원형의 달걀 실 (그림 2D)의 극의 서브 세포 해상도 부족하다. 이에 따라서, 초 - 해상도 이미징 최신 기술 현미경으로 부분적 극복 될 수 있지만, 이러한 방법은 고가이고 항상 사용할 수 없습니다. 초파리는 24, 25은 훨씬 더 작은 달걀 챔버에 사용되는 배아에 대해 우리는 똑바로 이미징 프로토콜을 적용했다. 배아 비교 달걀 챔버 훨씬 작은 크기를 고려하는 방법에있어서 몇 가지 중요한 변경이있다. 설명 된 기술의 핵심 구성 요소는 물리적 인 separ배아의 필요하지 않은 개인 실의 ATION. 또 다른 변화는 (4.4)를 장착하는 동안 제 글리...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

시약에 대한 파리 커뮤니티 구성원, 특히 Denise Montell 박사, Lynn Cooley 박사 및 Pernille Rorth 박사의 도움에 감사드립니다. 플라이베이스(Flybase), 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center), 발달 연구 하이브리도마 은행(Developmental Studies Hybridoma Bank)에 각각 플라이 스톡과 항체를 제공하고 정보를 제공해 주신 데 감사드립니다. LM은 교육부 보조금, GAANN(Graduate Assistance in the Areas of National Need) 교육 펠로우십(P200A120017) 및 NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant(2 R25-GM55036)의 지원을 받습니다. 현미경 검사의 일부는 NSF MRI 보조금 DBI-0722569 및 Keith R. Porter Core Imaging Facility의 지원을 받았습니다. 이 연구는 MSG에 수여된 NSF CAREER Award(1054422)와 March of Dimes의 Basil O'Connor Starter Scholar Award의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 M 인산칼륨 완충액 (KPO4 완충액)NaH2PO4&bull 3.1 g을 추가합니다. H2O 및 10.9g의 Na2HPO4(무수)를 증류된 H2O로 증류하여 1L의 부피를 만듭니다. 최종 용액의 pH는 7.4입니다. 이 버퍼는 4°C에서 최대 1개월 동안 저장할 수 있습니다.
16% 파라포름알데히드 수용액, EM 등급전자 현미경 과학15710메탄올-프리로 GFP 형광을 보존합니다
30G x 1/2 인치 바늘 VWRBD305106Regular bevel
Active DryYeast Genesee Scientific62-103암컷 파리를 살찌우기 위해
소 혈청 알부민PAA-cell culture companyA15-701NP40 세척 버퍼
Dumont # 5 집게Fine Science Tools11295-10Dumostar 합금, 생물학 팁; 날카로운 팁은 난소 박리
에 필수적입니다.DAPI (4 ′ , 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma AldrichD95425 mg / ml 원액   
태아 소 세럼 (FBS)Life Technologies16140-071보충 해부 매체에 추가 (10%) 
유리 문화 튜브VWR47729-57614 ml
유리 함몰 슬라이드VWR470019-0201.2 mm 두께, 이중 구멍
글리세린 젤리 Electron Microsocpy Sciences17998-10마운팅 미디어
글리세롤IBI ScientificIB1576070% in PBS
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI3021-500ML(Nonidet P-40과 교체 가능)  NP40 세척 버퍼에 사용 
라이카 형광 입체경 Leica Microsystems
Leica SP5 컨포칼 현미경Leica Microsystems40x/0.55NA 건조 대물렌즈 
마이크로 스패튤라 VWR82027-518스테인레스 스틸
현미경 슬라이드VWR16004-36875x25x1 mm
NP40 세척 버퍼50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA 및 0.02% 아지드화
나트륨 페니실린-스트렙토마이신-글루타민Life Technologies10378-016해부 매체 (0.6X)
Petridish-Polysterine, 멸균을 보충하기 위해 추가VWR82050-54860 W x 15 H mm
인산 버퍼 식염수시그마 알드리치P3813-10PAK분말
칼륨 인산 이염기성시그마 알드리치P3786-500G0.1 M KPO4 버퍼에 사용됨 
인산 칼륨 단일염기성 시그마 AldrichP9791-500G는 0.1 M KPO4 버퍼에 사용됩니다.
[헤더]
슈나이더' s 곤충 MediumLife Technologies
11720018		L-글루타민 및 중탄산나트륨
지드화나트륨 시그마 알드리치S2002-25G형광 항체 염색에 사용
염화나트륨시그마 알드리치S3014-500GNP40 세척 버퍼에 사용
TRIS-HClIBI ScientificIB701441m TRIS-HCl, pH 7.4
Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어PerkinElmer공초점 Z 스택 처리용
아

참고문헌

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