마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Summary

Cold Plantar Assay(CPA)는 30°C에서 5°C 사이의 추위 반응성을 측정하고 추위 적응도 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

Abstract

한랭 과민증은 심각한 임상적 문제로, 광범위한 환자에게 영향을 미치고 삶의 질을 현저히 저하시킵니다. 저온 발바닥 분석법을 사용하면 생쥐의 추위 민감도를 객관적이고 저렴하게 평가할 수 있으며 진통과 과민증을 모두 정량화할 수 있습니다. 쥐는 유리판에 순응하고 압축된 드라이아이스 펠릿을 뒷발 아래의 유리 표면에 대고 고정합니다. 냉각 유리에서 인출까지의 대기 시간은 추위 민감도의 척도로 사용됩니다.

차가운 느낌은 계절에 따라 온도가 변하는 지역에서 생존하는 데도 중요하며, 민감도를 유지하기 위해 동물은 주변 온도에 맞게 열 반응 임계값을 조정할 수 있어야 합니다. 또한 CPA(Cold Plantar Assay)를 통해 30°C에서 5°C 범위의 온도에서 마우스의 저온 민감도를 테스트하여 주변 온도 변화에 대한 적응을 연구할 수 있습니다. 마우스는 상기와 같이 순응하지만, 유리판은 뜨거운 물, 젖은 얼음 또는 드라이 아이스로 채워진 알루미늄 상자(또는 알루미늄 호일 패킷)를 사용하여 원하는 시작 온도로 냉각됩니다. 플레이트의 온도는 필라멘트 T형 열전대 프로브를 사용하여 중앙에서 측정됩니다. 플레이트가 원하는 시작 온도에 도달하면 위에서 설명한 대로 동물을 테스트합니다.

이 분석을 통해 무해한 온도에서 유해한 온도까지 다양한 온도에서 마우스를 테스트할 수 있습니다. CPA는 다치지 않은 마우스에서 명확하고 일관된 행동 반응을 생성하며 과민증과 진통을 모두 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

Introduction

설치류 냉 반응성 측정은 모두 정상 및 병리학 적 조건 하에서 인간 감기 감도의 전위 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것이 중요하다. 콜드 발바닥 분석 (CPA)는 원래 전 ¹ 몇 년이, RT에 전달 차가운 자극에 재현, 모호하지 않은 쥐의 행동 반응을 생성하도록 설계 개발했다. 이러한 분석의보다 최근의 ^개선이 온도의 넓은 범위에서 감기 감도 측정 재현성있게되었다. 두 버전은 상대적으로 높은 처리량, 사용이 저렴하도록 설계되어 있습니다.

진보는 많은 다른 방법을 이용하여 행동 민감성 감기 메커니즘을 이해에서했다. 하나의 방법은 dabbing 또는 마우스 발에 분사하고 아세톤 마우스 발바닥 ^3,4 플릭 소비하는 시간의 양을 측정하는 것을 포함 아세톤 증발 시험이다. 불행하게도,아세톤의 증발에 대한 응답은 젖은 감각과 아세톤의 냄새에 의해 혼동된다. 또한, 아세톤 증발 시험에서인가되는 냉 자극을 적용 아세톤의 양을 기준으로 정량화하기 어렵다 변할 수있다. 마지막으로, 손상되지 않은 마우스는 기준선 아세톤 최소한 응답이 불가능이 방법 과민증의 부재 진통을 측정 할 수있다.

차가운 반응에 대한 또 다른 고전적인 분석은 꼬리가 차가운 물....

Protocol

모든 마우스 프로토콜은 건강 지침 국립 연구소에 따라이었고, 의학의 워싱턴 대학의 동물 연구위원회 (세인트 루이스, MO)에 의해 승인되었다.

1. 테스트 판 및 인클로저 준비

1. 유리 표면을 청소합니다.
2. 실험실 테이프로 유리판의 중앙에 표면에 T 형 필라멘트 열전쌍 프로브를 고정.
3. 플레이트의 중앙을 따라 한 줄로 유리 접시에 동물 인클로저를 놓습니다.
4. 중앙 동물 인클로저를 통해 열전쌍 프로브를 끼 우고 데이터 로거에 연결합니다. 자동 종료 기능을 비활성화하는 동안의 데이터 로거를 켜고 제공된 케이블로 컴퓨터에 데이터 로거를 연결합니다.
   1. 실험 기간 동안 판의 온도를 기록하는 경우, 플레이트 온도 기록을 시작하기 위해 데이터 로거 소프트웨어를 엽니 다.
   2. 필요하다면, 다시 소프트웨어를 조정코드 플레이트 온도 매초마다.
   3. 열 데이터 로거와 함께 패키지 소프트웨어를 사용하여 온도를 기록 시작합니다.
5. 마우스 사이의 시각적 상호 작용을 방지하기 위해 검은 삽입 인클로저를 분리합니다.
6. 위치는 인클로저의 밑면이 편안한 장착 위치에서 볼 수 있도록 유리 아래에 반영한다.

Results

30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 시작 마우스에서 유발 행동 반응이 높은 재현성 (그림 4A) ^(20)이다. 뒷발에 따라 발생되는 냉 자극을 측정하기 위하여, 마우스를 케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진 칵테일로 마취하고 그의 발은 T 형 필라멘트 열전대 (도 4b) ^(20)의 상부에 유리에 고정 하였다. 유리 냉각하거나 원하는 테스트 범위로 가온 하였다. 판은 판 (도 5a) ^(2)의 길이를 따라 균일하게 냉각되어 있지만, 저온 구배가 동작 인클로저 (도 ^5B)이 양단에 발생되는 것은 아니다. 중앙부가 약간 따뜻 (도 ^{5b)을 2} 동안 인클로저의 양쪽에 드라이 아이스에 가까운 인클로저 부분은 냉각기이.......

Discussion

CPA는 마우스의 냉감 민감성과 냉기 적응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다양한 온도 범위에서 억제되지 않고 적응한 동물의 냉기 반응을 측정하는 저렴하고 효율적인 방법을 제공합니다. 또한 쉽게 정량화되고 분석되는 출력 변수를 통해 명확한 행동 응답을 제공합니다. 염증¹, 신경병성 손상¹, 진통제¹, 유전적 녹아웃²⁰ 및 유전적 뉴런 절제 연구²⁶에 의해 유발된 냉감도의 변화를 평가하는 데 이미 사용되었습니다. 다양한 두께의 유리를 사용하여 다양한 냉각 속도에 대한 반응을 측정하도록 수정할 수 있으며, 적용되는 냉자극의 크기는 다양한 크기의 주사기를 사용하여 변경할 수 있습니다.

이 분석을 올바르게 수행하기 위한 가장 중요한 단계는 테스트 중에 유리판을 고르게 냉각하거나 예열하는 것입니다. 알루미늄 상자를 동물 인클로저의 양쪽에 균일한 간격으로 배치하도록 조심스럽게 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
T 형 열전대 프로브	Physitemp	IT-24p	유리의 표면 온도를 측정하는 데 사용 (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
유리판	지역 유리 회사 (St. Louis, Stemmerich Inc)		를 사용합니다. 우리 연구실은 일반적으로 1/4 "를 사용하지만 3/16 "및 1/8"도 유용한
열 데이터 로거	Extech	EA15	Thermologger 유리 온도 (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml 주사기	BD	309657	상단을 절단하고 주사기에서 드라이 아이스를 압축하여 콜드 프로브
컴퓨터를	생성합니다.Extech 로거를 사용하는 경우, 모든 Pcwill 작업
알루미늄 상자	워싱턴 대학교의 세인트루이스 기계 공장		상자는 길이 3', 너비 4.5', 높이 3'이며 뚜껑이 밀봉되어 있습니다.  바닥 근처의 각 상자의 한쪽 짧은면에 1/2 "구멍이 뚫려 있습니다. 이 구멍은 상자에 젖은 얼음이나 뜨거운 물이 채워질 때 고무 마개로 채워집니다.
가열수 순환기	VWR		펌프가 있는 모든 물 순환기 모델이 작동합니다
21G 바늘	BD	305165	정확한 바늘 크기는 중요하지 않습니다
핸드 타이머			모든 핸드 타이머가 작동합니다
거울			모든 평면 거울이 작동합니다