마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Summary

Cold Plantar Assay(CPA)는 30°C에서 5°C 사이의 추위 반응성을 측정하고 추위 적응도 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

Abstract

한랭 과민증은 심각한 임상적 문제로, 광범위한 환자에게 영향을 미치고 삶의 질을 현저히 저하시킵니다. 저온 발바닥 분석법을 사용하면 생쥐의 추위 민감도를 객관적이고 저렴하게 평가할 수 있으며 진통과 과민증을 모두 정량화할 수 있습니다. 쥐는 유리판에 순응하고 압축된 드라이아이스 펠릿을 뒷발 아래의 유리 표면에 대고 고정합니다. 냉각 유리에서 인출까지의 대기 시간은 추위 민감도의 척도로 사용됩니다.

차가운 느낌은 계절에 따라 온도가 변하는 지역에서 생존하는 데도 중요하며, 민감도를 유지하기 위해 동물은 주변 온도에 맞게 열 반응 임계값을 조정할 수 있어야 합니다. 또한 CPA(Cold Plantar Assay)를 통해 30°C에서 5°C 범위의 온도에서 마우스의 저온 민감도를 테스트하여 주변 온도 변화에 대한 적응을 연구할 수 있습니다. 마우스는 상기와 같이 순응하지만, 유리판은 뜨거운 물, 젖은 얼음 또는 드라이 아이스로 채워진 알루미늄 상자(또는 알루미늄 호일 패킷)를 사용하여 원하는 시작 온도로 냉각됩니다. 플레이트의 온도는 필라멘트 T형 열전대 프로브를 사용하여 중앙에서 측정됩니다. 플레이트가 원하는 시작 온도에 도달하면 위에서 설명한 대로 동물을 테스트합니다.

이 분석을 통해 무해한 온도에서 유해한 온도까지 다양한 온도에서 마우스를 테스트할 수 있습니다. CPA는 다치지 않은 마우스에서 명확하고 일관된 행동 반응을 생성하며 과민증과 진통을 모두 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

Introduction

설치류 냉 반응성 측정은 모두 정상 및 병리학 적 조건 하에서 인간 감기 감도의 전위 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것이 중요하다. 콜드 발바닥 분석 (CPA)는 원래 전 ¹ 몇 년이, RT에 전달 차가운 자극에 재현, 모호하지 않은 쥐의 행동 반응을 생성하도록 설계 개발했다. 이러한 분석의보다 최근의 ^개선이 온도의 넓은 범위에서 감기 감도 측정 재현성있게되었다. 두 버전은 상대적으로 높은 처리량, 사용이 저렴하도록 설계되어 있습니다.

진보는 많은 다른 방법을 이용하여 행동 민감성 감기 메커니즘을 이해에서했다. 하나의 방법은 dabbing 또는 마우스 발에 분사하고 아세톤 마우스 발바닥 ^3,4 플릭 소비하는 시간의 양을 측정하는 것을 포함 아세톤 증발 시험이다. 불행하게도,아세톤의 증발에 대한 응답은 젖은 감각과 아세톤의 냄새에 의해 혼동된다. 또한, 아세톤 증발 시험에서인가되는 냉 자극을 적용 아세톤의 양을 기준으로 정량화하기 어렵다 변할 수있다. 마지막으로, 손상되지 않은 마우스는 기준선 아세톤 최소한 응답이 불가능이 방법 과민증의 부재 진통을 측정 할 수있다.

차가운 반응에 대한 또 다른 고전적인 분석은 꼬리가 차가운 물 ^5,6에 침지 한 후 철수 대기 시간을 측정 꼬리 영화 분석이다. 이 분석에서 행동 반응가 명확한 및 분석은 특정 온도에 대한 반응을 측정하는 동안, 동물은 잘 설명 스트레스 유발 진통 메커니즘 ^(7)를 통해 차가운 응답을 변경할 수있는, 테스트 기간 동안 억제해야합니다.

일반적으로 사용되는 또 다른 도구는 행동을 측정하는 냉각 판 테스트입니다마우스의 응답은 그들이 펠티어 냉각 판 ^8-10에 배치 된 후. 이 도구는 특정 온도에서 동물의 응답에 대한 정보를 제공하지만, 그것은 또한 일관성없이 사용되어왔다; 상이한 그룹 점프 ^8,11 수, 제 ^{13 8,11-} 응답 대기 시간을 포함한 다른 종류의 반응을 측정하고, 발과의 수는 매우 다른 결과 ^{11,13,14 리프트.} 콜드 플레이트 분석은 한번에 시험 할 수 하나만 동물로 비교적 낮은 스루풋이며 비싸고 깨지기 펠티에 소자를 필요로한다.

2 판 온도 환경 시험 동물이 서로 다른 온도 ^{9,15- (17)이} 연결 판에 보내는 시간의 상대적인 양을 측정 냉각 판 시험의 일반적으로 사용되는 파생 상품이다. 또 다른 유사한 분석은 일반적으로 사용되는 열 구배 분석 생쥐으로 다른 온도 대에서 보내는 시간의 양긴 금속 접시에 5 ° C와 45 ° C 사이의 범위는 ^(16)을 측정한다. 이러한 분석은 온도의 비교를 할 수 있지만, 그것은 행동이 온도 회피 또는 온도 취향을 나타내는 지 여부를 명확하지 않다.

마지막으로, 냉각 판 동적 분석은 마우스 ⁽¹⁸⁾ 주변의 온도 ^변화에 어떻게 반응하는지 측정하기 위해 사용되었다. 이 방법은 RT의 펠티어 장치에 마우스를 놓고 마우스 점프 또는 다른 판의 온도에서 자신의 발을 핥고 얼마나 측정하면서 1 ° C로 낮아진다 포함한다. 이 마우스는 냉각 환경에 적응하는 방법을 테스트하는 동안, 마우스는 냉각기 주위 온도의 환경에서 냉 자극에 반응하는 방법을 테스트하기위한 방법을 제공하지 않는다. 또한, 그것을 수행하기 위해 고가의 장비를 필요로하며, 그 감기 감도를 측정하기 전에 테스트 장비에 쥐를 적응 방법을 제공하지 않는다.

이러한 분석을 보완하기 위해, CPA는 ACCLIMA을 테스트다양한 온도 범위에서 잘 정의 냉 자극에 응답 테드 또는 차가운 주변 온도에 적응하는 과정. 그것은 저렴한 비용으로 높은 처리량 테스트를 위해 확장 할 수있는 가능성과 함께, 우리의 현재 장치에 한 번에 14 마우스까지 테스트 할 수 있습니다.

Protocol

모든 마우스 프로토콜은 건강 지침 국립 연구소에 따라이었고, 의학의 워싱턴 대학의 동물 연구위원회 (세인트 루이스, MO)에 의해 승인되었다.

1. 테스트 판 및 인클로저 준비

1. 유리 표면을 청소합니다.
2. 실험실 테이프로 유리판의 중앙에 표면에 T 형 필라멘트 열전쌍 프로브를 고정.
3. 플레이트의 중앙을 따라 한 줄로 유리 접시에 동물 인클로저를 놓습니다.
4. 중앙 동물 인클로저를 통해 열전쌍 프로브를 끼 우고 데이터 로거에 연결합니다. 자동 종료 기능을 비활성화하는 동안의 데이터 로거를 켜고 제공된 케이블로 컴퓨터에 데이터 로거를 연결합니다.
   1. 실험 기간 동안 판의 온도를 기록하는 경우, 플레이트 온도 기록을 시작하기 위해 데이터 로거 소프트웨어를 엽니 다.
   2. 필요하다면, 다시 소프트웨어를 조정코드 플레이트 온도 매초마다.
   3. 열 데이터 로거와 함께 패키지 소프트웨어를 사용하여 온도를 기록 시작합니다.
5. 마우스 사이의 시각적 상호 작용을 방지하기 위해 검은 삽입 인클로저를 분리합니다.
6. 위치는 인클로저의 밑면이 편안한 장착 위치에서 볼 수 있도록 유리 아래에 반영한다.

2. 온난화 / 유리 접시를 냉각

1. 가온 물에 젖은 얼음, 드라이 아이스 알루미늄 상자를 채우고 유리판 상에 적절하게 위치 (드라이 아이스로 채워진 알루미늄 호일 패킷과 같은 유리를 냉각하기 위해 사용될 수있다;도 1) ^2.
   1. 30 ° C에서 테스트를 위해, 멀리 동물 인클로저 (그림 2B) ^2에서 '약 0.25 알루미늄 상자를 배치합니다.
      1. 유리 기판의 양측에 가열 된 물이 순환 장치를 설정한다. 45 서큘 레이터 설정 - 60 ° C가, 우리뜨거운 물 (그림 1C) ^2의 꾸준히 알루미늄 상자를 채우기 위해 전자.
      2. 서큘 레이터의 위치를 같은 알루미늄 상자에서 뜨거운 물이 다시 직접 각면 (그림 1C)에 순환의 저수지에 배수 것을 ^2.
   2. 실온에서 테스트를 위해 상자를 빈 (그림 2) ^(2)를 둡니다.
   3. (그림 2) 17 ° C에서 테스트를 위해, 거리 양쪽에 동물 우리에서 '약 0.25 상자를 놓고 젖은 얼음 채우기 ^2.
   4. (그림 2) 12 ° C에서 테스트를 위해, 거리 양쪽에 인클로저에서 '약 1.25 상자를 놓고 드라이 아이스 채우기 ^2.
   5. (그림 2) 5 ° C에서 테스트를 위해 약 0.25 ''거리 양쪽에 인클로저에서 상자를 놓고 드라이 아이스 채우기 ^2.
      1. 드라이 아이스와 유리를 냉각 할 때, 방에 _{이산화탄소} 발생을 방지하기 위해 통풍이 있는지 확인하십시오.
2. 원하는 온도 범위에 도달하는 유리 기다립니다.
3. 접시에 인클로저에 마우스를 추가합니다.
   주 : 백색 잡음 발생기 잡음 교란을 감소하기 위해 사용될 수있다.
4. 마우스 적응 기다립니다.
   참고 : 우리 시설에서이 약 2.5 시간이 필요하지만이 동물 하우징 및 취급 조건에 따라 상당히 다를 수 있습니다.
5. 상자를 따뜻하게 물, 젖은 얼음 또는 드라이 아이스의 전체 유지하도록하여 원하는 온도 범위에서 유리를 유지한다.
   참고 : 우리의 장치와 함께 상자 얼음 대략 매 90 분 리필 할 필요가있다.
   주 : 17 ° C 조건의 경우,이 얼음을 보충하기 전에 배수 구멍을 통해 알루미늄 상자에서 대부분의 물을 비우는 것이 도움이된다. 이것은 더 나은 온도, 및 PR을 안정화이벤트 오버 플로우
   주 : 드라이 아이스의 정확한 양은 계절에 따라 다르지만, 일반적으로 온도를 일정하게 유지한다 상자의 전체 길이를 따라 완전 이상 박스 ¼ 유지한다.

고정 온도에서 3. 테스트 마우스

1. 행동 방 밖에서, 드라이 아이스의 전체 절반에 대한 얼음 양동이를 입력합니다.
2. 망치 또는 망치를 사용하여 미세 분말로 드라이 아이스를 분쇄.
   참고 : 버킷을 너무 가득 채우면하는 것은 어려운 완전히 분말로 드라이 아이스 호감을 만들 것입니다.
3. 직선 면도날이나 가위를 사용하여, 3 ML의 주사기를 상단을 잘라.
4. 21 G 바늘을 사용하여, 주사기 (6 구멍 전체)에 대향하는 측면 (3) 구멍을 찌를.
   주 : 드라이 아이스를 압축하면서이 구멍은 승화에 의해 생성 된 압력이 감소한다. 컷오프 주사기 여러 실험을 위해 재사용 될 수있다.
5. 주사기, 드라이 아이스 분말, 및 행동 방에 휴대용 스톱워치를 가져 가라.
6. 드라이 아이스 분말의 절반 전체 주사기 챔버를 입력합니다. 평면 객체와 주사기의 절단 끝을 잡고 단단히 플런저를 사용하여 분말을 압축합니다. 주의; 플라스틱 플런저는 구부리거나 압력에서 중단 될 수 있습니다. 이 경우, 새로운 주사기에서 플런저를 교체합니다.
7. 주사기의 가장자리를지나 압축 된 드라이 아이스 펠릿의 끝을 확장합니다.
8. 휴식을 충분히입니다 테스트 마우스.
   1. 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C에서 4 유리에 발 및하지를 테스트 마우스는 이동하지만, ¹⁹ 완전히 잠이 없습니다.
   2. 12 ° C 5 ° C에서, 이동하거나 점프 2 발, 4 발과하지에있는 테스트 마우스.
9. 부드럽게, 타겟팅을 위해 거울을 사용하여 단단히 마우스 뒷발 (그림 ^1A)이 아래 유리 표면에 평평 펠릿 플러시를 누릅니다. 손으로 타이머를 시작합니다.
10. 타이머를 중지하고 마우스가 떨어져 냉각 된 유리에서 이동할 때 펠렛을 제거합니다.
    참고 : 철수 운동이 수직 또는 수평이 될 수 있습니다.
    1. 마우스가 매우 간략하게 발을 이동 한 후 냉각 표면에 반환하는 경우 마우스가 떨어져 영구적 인 이동을하게 될 때까지, 타이밍과 자극을 계속합니다.
       참고 : 우리 연구소는 대부분의 경우에 마우스 20 초 최대 자극 시간을 사용합니다.
11. 각 동물의 각 발에 3 개 이상의 값을 수집 할 때까지이 테스트 절차를 반복합니다. 적어도 15 분에 의해 단일 ​​발에 적어도 7 분, 별도의 연속 시험하여 동일한 마우스에 반대 발을 테스트 별도의 시험.
12. 필요한 경우, 냉각 (그림 3) ^(1)의 서로 다른 속도를 생성하는 유리의 다른 두께를 사용합니다.
    주 : 냉각 속도가 반비례 유리의 두께와 상관된다.

4. 콜드 적응하는 동안 마우스를 테스트

주 :이 작은지면 유리로 테스트 할 수 대체 프로토콜전자는 오히려 판을 안정화하고 마우스가 완전히 추운 환경에 적응 한 번 이상, 냉각시킨다.

1. 장치를 설정하는 제 1 절에 나와있는 지침을 따르십시오.
2. RT (그림 7A) ^2에서 기준 측정을 수행하기 위해 제 3 절에 나와있는 지침을 따르십시오.
3. 드라이 아이스와 알루미늄 상자를 사전 냉각.
4. 기준 철수 대기 시간을 측정 한 후, 멀리 인클로저의 양쪽에 접시 약 1.25 ''의 미리 냉각 된 상자의 위치 (그림 7a는, 화살표가 표시된 "드라이 아이스 추가") ^2.
5. 유리 접시가 냉각됨에 따라 가능한 한 자주 측정을, 측정을 수행 할 제 3 절에 나와있는 지침을 따르십시오.

Results

30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 시작 마우스에서 유발 행동 반응이 높은 재현성 (그림 4A) ^(20)이다. 뒷발에 따라 발생되는 냉 자극을 측정하기 위하여, 마우스를 케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진 칵테일로 마취하고 그의 발은 T 형 필라멘트 열전대 (도 4b) ^(20)의 상부에 유리에 고정 하였다. 유리 냉각하거나 원하는 테스트 범위로 가온 하였다. 판은 판 (도 5a) ^(2)의 길이를 따라 균일하게 냉각되어 있지만, 저온 구배가 동작 인클로저 (도 ^5B)이 양단에 발생되는 것은 아니다. 중앙부가 약간 따뜻 (도 ^{5b)을 2} 동안 인클로저의 양쪽에 드라이 아이스에 가까운 인클로저 부분은 냉각기이...

Discussion

CPA는 마우스의 냉감 민감성과 냉기 적응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다양한 온도 범위에서 억제되지 않고 적응한 동물의 냉기 반응을 측정하는 저렴하고 효율적인 방법을 제공합니다. 또한 쉽게 정량화되고 분석되는 출력 변수를 통해 명확한 행동 응답을 제공합니다. 염증¹, 신경병성 손상¹, 진통제¹, 유전적 녹아웃²⁰ 및 유전적 뉴런 절제 연구²⁶에 의해 유발된 냉감도의 변화를 평가하는 데 이미 사용되었습니다. 다양한 두께의 유리를 사용하여 다양한 냉각 속도에 대한 반응을 측정하도록 수정할 수 있으며, 적용되는 냉자극의 크기는 다양한 크기의 주사기를 사용하여 변경할 수 있습니다.

이 분석을 올바르게 수행하기 위한 가장 중요한 단계는 테스트 중에 유리판을 고르게 냉각하거나 예열하는 것입니다. 알루미늄 상자를 동물 인클로저의 양쪽에 균일한 간격으로 배치하도록 조심스럽게 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
T 형 열전대 프로브	Physitemp	IT-24p	유리의 표면 온도를 측정하는 데 사용 (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
유리판	지역 유리 회사 (St. Louis, Stemmerich Inc)		를 사용합니다. 우리 연구실은 일반적으로 1/4 "를 사용하지만 3/16 "및 1/8"도 유용한
열 데이터 로거	Extech	EA15	Thermologger 유리 온도 (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml 주사기	BD	309657	상단을 절단하고 주사기에서 드라이 아이스를 압축하여 콜드 프로브
컴퓨터를	생성합니다.Extech 로거를 사용하는 경우, 모든 Pcwill 작업
알루미늄 상자	워싱턴 대학교의 세인트루이스 기계 공장		상자는 길이 3', 너비 4.5', 높이 3'이며 뚜껑이 밀봉되어 있습니다.  바닥 근처의 각 상자의 한쪽 짧은면에 1/2 "구멍이 뚫려 있습니다. 이 구멍은 상자에 젖은 얼음이나 뜨거운 물이 채워질 때 고무 마개로 채워집니다.
가열수 순환기	VWR		펌프가 있는 모든 물 순환기 모델이 작동합니다
21G 바늘	BD	305165	정확한 바늘 크기는 중요하지 않습니다
핸드 타이머			모든 핸드 타이머가 작동합니다
거울			모든 평면 거울이 작동합니다