방법 논문

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적​​인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에 폐렴 구균

DOI:

10.3791/52649

⸱

2015년 4월 25일

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department of Bioinformatics and Biotechnology, Government College University Faisalabad

이 논문에서

요약

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이 원고는 DNA 마이크로어레이가 제공하는 최첨단 기술의 사용을 설명합니다. 마이크로어레이는 특정 조건에서 발생한 박테리아의 전사체 변화에 대한 개요를 제공합니다. 또한 편리한 사내 개발 소프트웨어 패키지를 사용하여 많은 양의 데이터를 쉽게 분석할 수 있다는 점을 강조합니다.

초록

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유전자 발현 및 조절은 반응 조건이 다른 셀들의 동작을 이해하는 것이 매우 중요하다. 다양한 기술이 유전자 발현을 연구하기 위해 현재 사용되지만, 대부분의 전 사체의 발현을 제공하는 전체 화상의 관점에서 제한된다. DNA 마이크로 어레이는 전체 유전자 발현의 전체 개요를 제공 빠르고 경제적 연구 기술을 제공하고 수천을 분석하는데 도움도 사이트, 세포의 전사 활성의 특성화 및 바인딩 신규 유전자 전사 인자의 확인을 포함하여 광범위한 응용 번호를 가지고 유전자 (하나의 실험에서). 본 연구에서, DNA 마이크로 어레이 분석 세포 수확에서 세균 전 사체 분석을위한 조건이 최적화되어있다. 계정으로 시간, 비용과 실험의 정확성을 촬영,이 기술 플랫폼은 세균 transcripto 연구를위한 매우 유용하고 보편적 applicabale 것으로 입증MES. 여기서 우리는 S.의 전사 반응을 비교하여 대소 연구 등의 폐렴 구균과 DNA 마이크로 어레이 분석을 수행 폐렴 L 배지에 세린의 다양한 농도의 존재 하에서 성장. 총 RNA는 RNA의 품질 검사 키트를 사용하여 조사 하였다 RNA 분리 키트 및 RNA의 품질을 사용하여 Macaloid 방법을 사용하여 단리 하였다. cDNA를 역전사 효소를 사용하여 제조하고, cDNA를 시료는 두 아민 반응성 형광 염료 중 하나를 사용하여 라벨링 하였다. 제 DNA 마이크로 어레이 슬라이드의 cDNA 마이크로 어레이 데이터 전처리 워크 (Microprep)를 사용하여 분석 하였다 표지 된 cDNA 샘플 및 마이크로 어레이 데이터의 혼성화에 사용 하였다. 마지막으로 사이버 T는 통계적으로 유의 한 발현 된 유전자의 식별 Microprep을 이용하여 생성 된 데이터를 분석하는데 사용 하였다. 또한, 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 (고추, FIVA는 공개, 검사, Genome2D)를 분석하는 데 사용되었다데이터.

서론

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유전자 과발현 또는 녹 - 아웃을 포함하여, 특정 시간 또는 특정 조건 하에서 단세포 생물 또는 진핵 세포의 게놈에 의해 코딩 mRNA의 풍부 (사체)의 전체 세트의 연구는 transcriptomics 불린다. Transcriptomics 우리가 어느 정도 유전자 시점 X에서 특정 조건에서 발현되는 무엇을 관찰 할 수 있습니다 우리에게 유전자에 대한 참조를 기준으로 표시하는 방법을 강하게에 대한 정보를 제공합니다.

마이크로 어레이는 고체 기판 상에 2 차원 어레이 (일반적으로 유리 슬라이드 또는 실리콘 박막 셀) 높은 처리량 스크리닝을 사용하여 생체 물질의 대량 분석하는 데 사용하고, 소형화 될 수 있고, 다중화 및 병렬 프로세싱 및 검출이며 방법. 마이크로 어레이는 DNA-마이크로 어레이, 단백질 마이크로 어레이, 펩티드 마이크로 어레이, 조직 마이크로 어레이, 항체 마이크로 어레이, 세포 마이크로 어레이 등을 비롯한 다양한 형태로 왔습니다. DNA 마이크로 어레이는기본적 미세한 DNA 스폿의 조립체는 고체 표면에 고정 된 보통 유리. DNA 마이크로 어레이는 유전자의 발현 수준 또는 유전자의 동시 측정하는 세트 또는 게놈 2,3- 복수의 영역의 유전자형을 위해 사용된다. 프로브 Picomoles (10-12....

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프로토콜

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1. 미디어의 준비 및 세포 배양

  1. S. 성장 앞서 설명한 바와 같이 11 폐렴 D39 야생형 균주 21. 화학적 6.4 (15)의 최종 pH 중형 (CDM)가 정의 50 ㎖ 중의 (50 ㎖에 1/100의 비율 멸균 튜브) 10 % 글리세롤에 C o를 -80 저장된 세포에 접종하지만 아미노산으로부터 L 세린 생략 혼합물.
    주 : 두 개의 다른 CDMS 사용 하였다; L 세린 (10 mM)을 최대 농도를 함유하는 세린 L (150 μM) 및 기타의 최소 농도를 함유 한. 이러한 최소 농도는 기본적으로 인간 혈장 세린 L의 농도이며 목적은 S.의 유전자 발현을 비교하는 것이다 이 두 가지 조건에서 폐렴 D39 변형.

총 RNA 2. 분리

  1. 재료
    1. 총 RNA의 분리를 위해 산 페놀, RNA 등급을 사용합니다.
    2. Macaloid :
      1. 의 2g을 일시 중단100 ml의 TE에 macaloid 5 분 동안 끓인다. 50 ml의 TE pH가 8 점에서 4 ° C에서의 RT에서 5 분, 재현 탁 2,000 × ....

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결과

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RNA, cDNA를 절연 부 및 분석

L 세린은 필수 아미노산의 하나이며, 인간의 혈장 농도는 아동 및 성인에서 60-150 μM 다르다. 퓨린과 피리 미딘의 생합성의 역할은 신진 대사의 중요성을 강조하고 여러 아미노산 (글리신, 시스테인 및 트립토판)의 전조이다. S. 전체 사체에 L 세린의 영향을 연구 폐렴 D39 야생형 균주, 동일한 배지에서 최대 농도 (10 mM)을 그 성장에 대해 L 세린의 최소 농도 (150 μM)를 CDM에서 자라는 균주 D39의 마이크로 어레이 분석을 실시 하였다. 우선, 두 농도 하에서 성장 세포로부터의 총 RNA는 단리 하였다. RNA 샘플의 농도는 표 1에 나타내었다. 총 RNA의 품질은 품질 검사 분석을 이용하여 조사 하였다. 이 RNA를 수행하기 전에의 DNase I으로 처리 하였다분석은 가능한 게놈 DNA를 제거하는 그림 2

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토론

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우리는 세균의 전체 전 사체 분석을 수행하도록 적용될 수있는 사용자 친화적 인 프로토콜을 설명한다. 이러한 특정 기법에 대한 핵심은 세포가 수확되는 조건에 따라 달라질 것이다. 세포 RN​​A 분리 및 수확 후,이 기술은 박테리아 샘플 모든 유형과 정확히 동일하게 동일한 절차를 따르며, 따라서 세균 배양의 모든 유형에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 매우 간단하고 편리하고 RNA 분리에서 시작됩니다. (Macaloid 및 RNA 분리 키트를 사용하여) 우리 RNA 분리 프로토콜은 시간 효율적인 종래의 페놀 - 클로로포름과 트리 졸 방법에 비해 같다. 다음 단계에서, 효소 III 효소의 cDNA의 제조를 행한다. 다음에, cDNA를 라벨링 아민 반응성 염료의 cDNA 1 혼합에 의해 수행되고, 그 후 표지 된 cDNA를 정제. 라벨은 또한 간단하고 시료 약 1 배양해야하기에 많은 시간을 소요하지어둠 속에서 시간. 그것은 임의의 특수 장비를 필요로하지 않는 모든 이러한 단계는 임의의 표준 실험실에서 수행 될 수있다. 마이크로 어레.......

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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우리는 DNA 마이크로 어레이 슬라이드 생산에 대한 도움말 앤 드 종과 Siger Holsappel 감사합니다. 생물 정보학 분석을위한 앤 드 종의 지원도 받고있다. 우리는 또한 종이를 검토 할 Jelle Slager 감사합니다. 무하마드 아프과 이르판 Manzoor는 HEC 파키스탄의 교수 개발 프로그램에 따라 GC 대학, 파이 살라 바드, 파키스탄에서 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
산성 페놀SigmaAldrichP4682
Roche RNA 분리 키트Roche Applied Science11828665001
유리 구슬105015
클로로포름붐92013505.1000.
IAA106630
나노드롭나노드롭ND-100
애질런트 바이오 분석기애질런트G2940CA
Superscript III생명 공학 Invitrogen18080044
AA-dUTP생명 공학AM8439
DDT생명 공학
첫 번째 스트랜드 버퍼Life technologies Invitrogen18080044
NaOHSigmaAldrichS8045-1KG
HEPESSigmaAldrichH4034-500G
DyLight-550Thermoscientiffic62262
DyLight-650Thermoscientiffic62265
SHY 버퍼SigmaAldrichH7033-125ML
Speedvac 쿨러EppendorfRUGNE3140Speedvac 집중 장치 플러스
하이브리드화 오븐Grant BoekelIso-20
리프터 슬립Erie Scientific25x60I-M-5439
와이프KIMTECH
SDSSigmaAldrichL3771-100g
SSCSigmaAldrichW302600-1KG-K
Genpix 오토로더 4200A1MSD 분석 기술마이크로어레이 스캐너
중탄산나트륨SigmaAldrich104766
18080044

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
  2. Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods.

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태그

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