방법 논문

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

DOI:

10.3791/52652

⸱

2015년 7월 13일

 , 
1UMR Centre des Sciences du Goŭt et de l'Alimentation, CNRS, INRA, Université de Bourgogne

이 논문에서

요약

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후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

초록

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특정 리간드로 자극시 후각 감각 뉴런의 생리적 반응 (OSN)를 분석하는 것은 후각 구동 동작과 그 변조의 기초를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 코딩 특성은 냄새 분자와 후각 수용체 (OR) 사이의 초기 상호 작용에 크게 의존하는 OSNs로 표현. 명시 적 또는 중요한의 ID, 특이 리간드 스펙트럼. 또는의 리간드를 찾을 수있는 확률은 상피 내에서 무작위로 선택된 OSN 매우 낮은 표현했다. 이러한 과제를 해결하기 위해,이 프로토콜은 전적으로 정의 논리합의 프로모터의 제어하에 형광 단백질 GFP를 발현하는 태깅 된 마우스를 사용한다. OSNs는 이웃 세포가 자신의 성숙과 기능에 영향을 미치는으로, 비강 안감 꽉 및 조직 상피에 있습니다. 여기에서 우리는 OSNs 전자의 속성을 그대로 후각 상피를 분리하고 패치 클램프 녹음을 기록하는 방법을 설명정의 후각 수용체를 xpressing. 프로토콜은 인접한 조직의 영향을 유지하면서 하나 OSN 막 성질을 특성화 할 수있다. 패치 클램프 결과의 분석은 리간드 / 또는 상호 작용, 전달 경로 및 약리학, OSNs '코딩 특성과 막 수준에서 자신의 변조의 정확한 정량을 산출한다.

서론

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후각 감각 뉴런 (OSN)는 후각 인식의 첫 번째 단계를 나타냅니다. 설치류의 비강에 선을 긋고있는 후각 상피에 위치한, 그들은 뇌에 자신의 축삭을 통해 전송 활동 전위에 냄새 물질의 화학적 정보를 변환. 더 후각 부호화 메커니즘을 이해하기 위해서는 OSNs의 전달 및 막 특성을 특성화하는 것이 필요하다. 최근까지, 포유 동물 OSNs의 성질을 특성화하기 위해 사용되는 기법은 대부분 해리 OSNs 1-4에서 수행 하였다. 해리 과정은 자신의 환경에서 OSNs을 확보하기 위해 다양한 기계 및 화학 물질 (즉, 효소) 프로세스를 사용합니다. 이러한 과정은 녹화 가능 세포의 낮은 번호를 유도한다. 이러한 낮은 수는 GFP 표지 된 세포의 경우에 훨씬 더 중요 할 수있다. 해리도 및 OSNs surviv 중을 상승시킬 수 후각 상피의 다른 셀 간의 로컬 세포 간 상호 작용을 제거알과 OSNs '속성의 변조. 해리 과정을 생략하기 위해, 제제는 그대로 5 개발되었다.

각 OSN은 큰 multigene 가족 (6)에서 선택 (OR) 하나의 후각 수용체를 표현한다. 마우스의 주요 후각 상피 세포에서 발현 1,000 관찰 보고서는 ~가 있습니다. 인해 야생형 동물 OR의 다수에, 기회는 동일한 발현 OSNs 기록 OR 매우 낮은한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 표적으로 마우스를 사용할 수있는 식별 또는 형광 단백질 7-9로 표시되어 표현하는 모든 OSNs. 이 표시 OSNs는 해리 준비 앞에서 언급 한 단점과 7,10,11에 기능 분석을 수행 하였다. 유전자 표지 된 마우스의 상피 손상 5- 따라서 이러한 문제를 회피. 이것은 VI에서에 가까운 환경에서 정확하게 정의 논리합을 표현 OSNs의 활동의 모니터링을 허용가능한 한 VO. 게다가, OSNs의 패치 클램프 녹음도 막 특성, 전달 경로의 약리학, 리간드 / 또는 상호 작용의 정확한 분석을 할 수 있습니다. 이러한 모든 항목은 거의 세포 외 녹음을 사용하여 분석 할 수 없습니다. 우리 취제 수용체 SR1 및 MOR23 12,13 발현 OSNs의 응답을 모니터링하기 위해이 기술을 사용했다. 기술의 실현 가능성은 뉴런 15,16 표현 OSNs 14 발현 MOR23에 다른 그룹뿐만 아니라 다른 논리합에 의해 확인 하였다. OSNs의 정의 인구의 모니터링 (17) 노화, 이러한 개발 (14)와 같은 많은 다른 상황에서 그 특성의 분석으로 이어질 수, 부 취제 유도 소성 (18), 15 코딩 냄새에 후각 수용체의 서열 변화의 역할. 이 프로토콜은, 따라서 멤브레인 레벨에서 정의 OSNs의 기능적 특성을 모니터링하는 강력한 도구를 제공한다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 Université 드 부르고뉴의 동물 보호 지침을 다음과 Université 드 부르고뉴 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 동물

  1. 잭슨 연구소 가능한 유전자 조작 또는-IRES-tauGFP 마우스를 사용합니다. 이러한 마우스는 후각 기관 (19)의 축삭 타겟팅 및 개발을 분석하기 위해 닥터 피터 Mombaerts '실험실에서 개발되었다. 예를 들어, MOR23-IRES-tauGFP 라인, 재고 번호 006643는 공식 변형 이름 B6 곰, 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ을; 유사하게, SR1-IRES-tauGFP 라인은 재고 번호 6717의 공식 이름 B6 곰, 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ을.
  2. 동물의 연령에 대해서는 : 프로토콜의 더 나은 결과를 위해, 생후 2 4 주 사이에 동물을 사용한다. 이 연령 그룹에서 해부 쉽게 (부드러운 뼈, 탄력있는 후각 상피 세포)와 수지상 노브는 양방향입니다입니다gger 오래된 동물에 비교합니다.

전극 및 솔루션 2. 준비

  1. 자극 피펫의 경우 : 구입 피펫을 자극 prepulled. 그렇지 않으면, 수동으로 준비합니다.
    1. 화염을 사용하여, 선단에서 약 1cm의 6 1mm 유리 피펫을 구부리. 구멍에 의해 강화 1.5 CM 열 수축 관에이 여섯 피펫 플러스 바로 7 번째를 삽입합니다.
    2. 열은 배럴 함께 접착을 유지하기 위해 수축 배관. 배럴의 다른 말단에 추가로 열 수축 튜브를 연결합니다. 멀티 배럴 풀러와 함께이 자극 피펫을 당깁니다.
    3. 굽​​ 팁을 강화하기 위해 구멍 주위에 약간의 흰색 액체 접착제를 추가합니다. 건조 O를 /의 N하자.
  2. 일반 링어의 세포 외 액의 1 또는 2 L 준비 (MM에서 : 염화나트륨 (124)의 KCl 3, 황산 1.3, CaCl2를 2, NaHCO3를 26의 NaH 2 PO 4 1.25, 포도당 (15), pH가 7.6, 305 mOsm). 4 ° C에서 유지사용할 때까지.
  3. (MM)에 세포 원액 준비 : KCl을 70, KOH (53), 메탄 설 폰산 (30), EGTA 5, HEPES (10), 수 크로스 (70); pH가 7.2 (KOH), 310 mOsm. 사용까지 4 ℃에서 보관하십시오. 몇 주에 대 한 좋은.
  4. 실험 전에 (마지막 순간) 즉흥적 니 스타틴과 세포 내 기록 솔루션을 준비합니다.
    1. DMSO의 50 μl를 추가, 니 스타틴의 3 mg의 무게; 완전히 희석 될 때까지 소용돌이 20 초 후 2 ~ 3 분을 초음파 처리.
    2. 세포 내 원액 5ml에 DMSO-니 스타틴 용액 20 μl를 추가합니다. 소용돌이 20 초 후 3 분을 초음파 처리. 4 ° C에서이 솔루션을 유지하고 직사광선으로부터 보호, 니 스타틴은 빛에 민감한입니다. 이 용액을 몇 시간 동안 사용할 수있다. 매일 교체합니다.
    3. 후각 상피 준비가 현미경되면, 전극을 채우기 위해 불꽃 긴 노란색 팁 1 ML의 주사기에이 솔루션의 일부를 가지고; 직사광선으로부터 보호합니다. RT에서, 니 스타틴 용액 일단안정되지; 매 시간마다 주사기 또는 얼음에 보관 ㎖로 1 솔루션을 교체합니다.
  5. 내부 니 스타틴 솔루션을 15 ~ 20 MΩ의 저항과 긴 목과 작은 팁 (~ 2 μm의)를 얻기 위해 풀러와 기록 전극을 당깁니다.
  6. 흄 후드 아래에 DMSO 0.5 M에서 취제 솔루션을 준비; 나누어지는 및 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 원하는 농도까지 링거액에 부 취제를 희석. 자극 피펫을 채 웁니다.

후각 상피 3. 준비

주 : OR-IRES-tauGFP 마우스는 OR 프로모터의 제어하에 tauGFP 표현. 이 마우스에서 관심의 또는를 표현하는 모든 신경 세포는 GFP로 표시되어 있습니다. 이 프로토콜은 모든 영역에서 발현 논리합하도록 구성된다. 그러나, 해부 및 녹음 등의 영역에서 표현 관찰 보고서에 대한 쉽다.

  1. 자일 라진 및 케타민 (150 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / ㎏ BOD의 혼합 주사하여 동물을 마취Y 무게, 각각). 참수는 젊은 쥐에 대한 이상 마우스에 대한 제대로 관리 설치류 단두대와 날카로운 가위로 수행 할 수 있습니다.
    1. 사용 링 해부 가위는 등쪽 피부를 통해 종 방향 내측 절개를합니다. 그것을 떨어져 당겨 피부를 제거합니다. 가위를 사용하여 턱 관절에서 아래턱을 잘라. 치아 관상 컷 병렬로 위 앞니를 제거합니다.
    2. 눈 뒤에 머리의 관상 컷을 확인하고 머리의 앞쪽 부분을 유지. 범위에서 해부를위한 얼음처럼 차가운 링거 용액에 담근다.
  2. 범위에서 해부 : 복부 측면에서, 위 턱 / 이빨을 따라 길이 절단을합니다. 비강 배측-외측부 다음, 종 지느러미 뼈를 잘라. 대부분의 뼈와 미각을 제거; 실온에서 산소 벨소리에 부착 된 격벽과 상피 세포를 전송합니다.
  3. 최종 절개의 경우 : 마우스 오른쪽 버튼으로 녹화를 시작하기 전에세션은, 집게로 기본 격막에서 상피를 벗겨. 집게와의 접착 성이 강한 격막의 앞쪽 부분에 두 4-5mm의 가위 컷 (사용 microvannas 가위)와 상피를 분리합니다.
    1. 조심스럽게 중격 상피에 그 등의 연결을 따라 밖으로 절단하여 골코 (vomeronasal) 기관을 제거합니다. 위로 향하게 점액층으로 기록 챔버로 이동 상피; 하프와 챔버에 평면을 유지.
  4. 형광 광학 및 민감한 카메라가 장착 된 수직 현미경 실을 설치합니다. 40X 물 침지 목표 (개구 0.8) 및 확대 렌즈에 의해 달성 여분의 2 배 또는 4 배 확대를 통해 높은 배율에서 컴퓨터 화면의 준비를 시각화. 실온에서 산소 벨소리 (1-2 ml / 분)와 함께 지속적으로 관류.

4. 녹음 세션

  1. 형광 셀에 대한 검색 : 480에서 준비를 자극530-550 nm의 범위에서 발광 용 나노 EGFP; 형광의 밝은 분야에서 확실하게 볼 수 있습니다 하나 수지상 노브를 대상으로.
  2. 니 스타틴과 세포 내 솔루션 전극을 채우기; 부드럽게 전극에 눌러 거품을 제거합니다.
  3. , 전극 홀더에 전극을 삽입 피펫에 긍정적 인 압력을 적용; 저항은 15 ~ 20 MΩ해야한다.
  4. 셀에 가까운 전극을 가져와; 저항 ~ 40 MΩ에 도달하면, 긍정적 인 압력을 해제하고 기가 시일에 도달하려면 약간의 부정적인 압력을 적용합니다.
  5. 시일에 도달하면, 약 -75 MV의 막 전위를 설정;
  6. 셀이 열리면 자극 프로토콜 약리 치료 진행. 단일 자극 취제, 기록 자발 활동 200-500 밀리에 대한 응답을 측정하기 위해 500 msec의 자극과 최대 10 초 13 대 세포의 반응을 측정한다. 약물 치료의 경우에서 약리 에이전트를 관류원하는 농도 (20).

5. 데이터 분석

  1. 그 다음으로 취제 자극 유도 전류를 분석 (밀리 초에서 최대 진폭의 90 %에 도달하는데 필요한 시간)의 최대 진폭, 상승 시간, 전체 전류 (PAS의 곡선 아래 영역), 시간을 50 % (개시 및 밀리에서 최대 진폭의 50 %의 응답 시간 사이의 오프셋).
    1. 그리는 힐 방정식을 이용하여 투여 량 반응 곡선에 맞는 서로 다른 농도 (최대 진폭에 도달) 피크 전달 전류를 사용 : I = 아이 맥스 / (1 ​​+ (K 1/2 / C) N) I는 피크 전류를 나타내고, , 최대 반응의 절반에 도달되었을 때의 K1 / 2 농도, C 취제의 농도이고; n은 힐 (Hill) 계수를 포화 농도에서 최대 반응을 IMAX.
  2. 최대 탈분극의 현재 클램프자는 tota을 막 전위의 기록을 분석L 전위 (mVsec에서 곡선 아래 면적)를 유발; 30 초 ~ 1 분 녹음을 통해 기록 자발적인 급상승 활동; 전류 (5 ~ 10 PA)의 주입에 의해 유도 스파이크를 통해 기록 흥분.

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결과

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이 프로토콜의 결과는 절개의 품질에 따라 달라집니다. 이 해부 단계는 짧은 (이하 10 분 ~ 15) 및 (즉, 상피 세포의 손상을 방지하기 위해) 정확해야합니다. 그림 1은 이상적인 준비가 다른 배율 수준에서처럼 보이는 방법을 보여줍니다. 밝은 필드 아래 낮은 배율 (예컨대 세포를지지 OSNs의 손잡이와 같은) 다른 유형의 세포는 구별 (도 1A)이다. 최대 배율 수준에서, 일반적으로 80X 160X에, 밝은 필드에 OSNs의 수지상 노브는지지 세포 (그림 1B)에서 명확하게 구별해야한다. 형광등 아래 만 수지상 노브와 GFP 표지 세포의 섬모 (그림 1C) 볼 수 있습니다. 두 이미지를 비교함으로써, 표지화 된 세포는 기록 피펫 (도 1D)으로 접근 할 수있다.

해부의 온도 때문에lution과 절개의 타이밍...

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토론

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올바르게 건강한 OSNs의 특성을 모니터링이 프로토콜의 능력은 제제의 품질에 크게 의존한다. 따라서, 해부 단계는 매우 중요하다. 첫째는 품질 (PH, 삼투압), 산소 및 온도 (빙냉하지만 냉동 생략) 해부 배지에 주목하는 것이 중요하다. 둘째, 해부 도구 상피의 조작 등의 손상을 피하기 위해 가능한 한 제한해야한다. 마지막으로, 가능한 최대 OSN 인구를 액세스하기 위해 가능한 한 평탄 제제를 얻는 것이 중요하다.

해부 품질은 건강한 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 해부를 지느러미 여기 우리는 복부를 제공하지만 일부 사용자는 빠르게 비강을 열고 후각 상피의 중격 홈에 빠르게 액세스 할 수있는 해부 등쪽을 시작하는 것을 선호 할 수 있습니다 그러나, 다른 방법은 절개 사용할 수 있습니다. 각 사용자는 따라서 홍보를 적용 할 수 있습니다관심 영역의 제조 건강한 도달하는 가장 효율적인 전략 otocol.

제제 현미경되면 제제의 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 OR-GFP 마우스를 관대하게 선물한 Peter Mombaerts에게 감사를 표합니다. 앤 르프랑(Anne Lefranc)과 CSGA 동물 시설은 훌륭한 동물 보호를 제공합니다. 자금은 ATIP 및 ATIP Plus 보조금을 통해 CNRS에서, Conseil Régional de Bourgogne(FABER 및 PARI 보조금), Université de Bourgogne(BQR 프로그램)에서 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
패러데이 케이지가 있는 진동 테이블TMC63-500 SERIES필요 : 환경에 의해 유발된 진동(실험자의 움직임, 냉각 컴퓨터용 팬과 같은 장비의 진동 등)으로부터 기록 시스템을 격리합니다. 패러데이 케이지와 함께 구입하거나 맞춤형 패러데이 케이지를 장착할 수도 있습니다. 이 케이지는 환경 광학 장치의
전기 노이즈를 피하기 위해 권장됩니다.현미경OlympusBX51WIupright microcope, epifluorescence가 장착되어 있습니다. 사용자의 선호도에 따라 고정 또는 이동 스테이지
LUMPLFL40XWOlympus최소 2개의 대물렌즈가 필요합니다: 세포에 대한 거친 접근을 위한 4X 또는 10X, 40X 침수 장거리 예: Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
돋보기OlympusU-TVCAC필수 사항: 대물렌즈와 카메라 사이의 광 경로에 배치됩니다. 기록 전극 사진기 올림푸스 DP72를 가진 손잡이를 정확하게 도달하기 위하여 스크린에 심상을 확대하는 것을 허용하는
좋은 사진기 형광에 있는 뿐 아니라 밝은 분야에서 신경을 볼 것을 요구된다; 통제 소프트웨어는 간단하 세포에 전극의 접근을 감시하기 위하여 사진을 찍고 살아있는 사진기 심상을 하는 것을 허용한다. 초고감도 카메라는 필요하지 않습니다
마우스에 사용된 형광 단백질에 따라 Olympus/Chroma를 필터링합니다. GFP의 예: 여기: BP460-490: 방출: HQ530/50m
HEKAPatchmaster는 실험 중 증폭기를 제어합니다.
SutterMP225정밀 미세 조작기는 마이크로미터의 1/10까지 정확한 움직임을 허용합니다; 이 모델은 매우 안정적입니다;
전극 풀러SutterP97을 드리프트할 수 있는 유압 조작기를 피하십시오.FT345-B 넓은 트로프 필라멘트 포함;   대략 2µ의 기록 피펫을 준비하기 위하여; 세포에 도달하는 긴 팁이있는 m 직경; 저항은 15-20Mohm이어야하며 천공 패치 클램프 솔루션
유리SutterBF120-69-10조건에서이 유리는 피펫
녹음 챔버Warner InstrumentsRC-26G이상적이며 챔버는 현미경으로 준비를 설정하는 데 필요합니다. 챔버 중앙에서 준비물을 유지하려면 그물/앵커를 사용해야 합니다.
유리WPITW100F-47개 그룹으로 연결되어 있으며, 이 피펫들은
배럴 풀러MDIPMP-107-Z, 이 풀러는 우리가 7개의 배럴 정밀 압력 주입기로 퍼핑 전극을 준비할 수 있게 해줍니다
.투히 컴퍼니P/N T25-1-900 싱글 채널     이 정밀 압력 인젝터는 멀티배럴 풀러에서 분출되는 압력을 제어합니다; 이것은 수동으로 또는 증폭기에 의해 5V  TTL
미세 매니퓰레이터NarishigeYOU-1거친 매니퓰레이터는 퍼핑 전극을 기록 사이트 튜빙에 가깝게 가져 오기에 충분합니다
: 패딩압력을 퍼핑 피펫
솔루션 / 관류 / 화학 물질
진공 펌프Gardner Denver300 시리즈진동 멤브레인 펌프는 다른 유형의 펌프보다 조용하고 효율적입니다
관류 시스템N/AN/A중력 관류 시스템, 기록 챔버에서 외부 용액을 반입 및 빼내는 폴리에틸렌 튜빙이 있는 시스템,
니스타틴Sigma-AldrichN3503천공 패치 클램프용 내부 용액을 퍼페이퍼하는 데 필수
DIMETHYL SULFOXIDESigma-AldrichD5879천공된 패치에 대한 내부 용액을 위해 Nystatin을 용해하는 데 사용됩니다.
염화나트륨시그마-알드리치S9625세포외용액
칼시그마-알드리치P4504세포내/세포외용액
칼슘 이수화물시그마-알드리치C7902세포외용액
인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4)시그마-알드리치S9638세포 외 용액
: 황산 마그네슘 헵타 하이드레이트 (MgSO4< / sub> 7H < > 2 < / sub>O)Sigma-Aldrich63140세포 외 용액
포도Sigma-AldrichG8270세포 외 용액
중탄산 나트륨Sigma-AldrichS6297세포 외 용액
EGTA (에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N&prime, - 테트라 아세트산)시그마 -알드리치E3889내부 용액
수산화 칼륨시그마 -알드리치P1767내부 용액
메틸 설폭 사이드시그마 알드리치W387509세포 내 용액
Hepes-Na시그마 알드리치H7006세포 내 용액
설탕시그마-알드리치S0389세포내 용액
는 것은 . 증폭기 HEKA EPC10 USB는 기록 전극을 통해 흐르는 전류를 모니터링하고 TTL 신호를 스프리처로 전송하여 퍼핑을 제어합니다. EPC10 설정은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 녹음 챔버를 기록하는 데 자극는 풀과 트위스트의 연관성을 통해 멀티를 준비하는 데 사용되며의 . , , , 염화륨 염화당

참고문헌

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