방법 논문

쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

DOI:

10.3791/52658

⸱

2015년 6월 9일

 , 
1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney

이 논문에서

요약

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망막전위도(ERG)는 빛에 반응하여 망막에서 생성되는 전위입니다. 이 논문은 어둡게 적응한 쥐에서 ERG를 사용하여 망막 기능을 평가하는 방법과 신경 보호 중재(현재의 경우 원격 허혈 전조건)를 평가하는 데 ERG를 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.

초록

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ERG는 모든 망막 활동의 합입니다. ERG는 일반적으로 각막에서 기록되며, 각막은 망막에서 신호를 수집하고 합산하는 안테나 역할을 합니다. ERG는 범망막의 망막 기능 변화를 민감하게 측정하는 방법이지만, 망막의 작은 영역에 국한된 손상을 감지하는 데는 덜 효과적입니다. 본 연구에서는 망막이 짧은 섬광에 노출될 때 생성되는 전위인 '섬광' ERG를 기록하는 방법을 설명합니다. 우리는 녹음 중 마취, 산동 및 각막 관리 방법을 설명합니다. 망막을 어둡게 유지하는 방법; 전극 재료 및 배치; 자극 에너지의 범위와 보정; 매개 변수 기록 및 데이터 추출. 또한 한쪽 팔다리에 허혈을 유도하는 방법과 ERG를 사용하여 빛 손상 후 망막 기능에 대한 이 망막에서 원격 허혈의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다. 다크 적응 ERG의 원뿔 구동 구성 요소를 분리하여 막대와 원뿔 구성 요소를 분리할 수 있는 2 플래시 프로토콜이 설명됩니다. ERG는 최소 침습적 기술로 기록할 수 있기 때문에 망막의 생리학, 약리학 및 독성학 연구에 널리 사용되었습니다. 우리는 이러한 유용성의 한 가지 예를 설명하는데, ERG는 신경 보호 중재의 유무에 관계없이 빛으로 손상된 망막의 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 원격 허혈에 의한 사전 조정.

서론

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ERG는 광에 응답하여 망막에 의해 발생하고, 눈의 각막 표면으로부터 기록 전위이다. 기록 조건을 신중하게 관리하는 경우, ERG 망막 기능을 평가하기 위해 다양한 방법으로 사용될 수있다. 여기서 우리는 '플래시 ERG', 망막 Ganzfeld 배경에 제시된 간단한, 밝은 플래시에 노출되었을 때 발생하는 전위를 기록하는 방법을 설명했다. Ganzfeld는 균일하게 빛을 분산 빛의 플래시가 약 균일하게 전체 망막에 도달한다. 망막을 기록하기 전에 어두운 적응되며, 동물의 기록을 위해 준비 될 때 어두운 적응이 유지되는 경우, ERG 두로드와 콘 감광체에 의해 생성된다 얻어진.

어두운 적응 플래시 에르그는 두 가지 방법으로 분석 된 특성 파형을 가지고 있습니다. 먼저, ERG 파형의 초기와 후기 컴포넌트 구별하고 뉴런의 시퀀스와 관련되어왔다망막 알 활성화. 최초의 구성 요소는 짧은 대기 시간에 음의 가능성, 파 (그림 1)입니다. 이것은 양의 진행 가능성이 뒤에, B 파를했다. B 파의 상승 단계는 별도의 구성 요소 (진동 전위 또는 OPS) 간주되는 진동을 보여줍니다. 파장은 감광체에 의해 생성 된 것으로 간주되며, 무 축삭 세포에 의한 1 층의 내측 핵 세포 및 OPS 의한 B 표면파.

자극 강도에 기초하여, 매우 희미 깜박에 응답 암순응 임계 반응이 가능하다 불린다. 암순응 임계 응답은 망막 신경절 세포 2-4에서 생성하는 것으로 이해된다. 둘째, 플래시 ERG 빛 적응에 의해 분리 될 수 있고, 또는 두 플래시 프로토콜에 의해 일단이 상기 조작 패널과 원뿔 중심 성분으로, 후술. 포토 픽 조건 하에서, 콘 인구가 낮기 때문에, 전파는 쥐에서 검출되지이지만 OPS와 B 파장은5 취소합니다. 그의 망막 높은 콘 인구가 영장류에서, 일단이 상기 조작 패널과 원뿔 경로 모두 검출 파 (6)를 생성합니다.

종종 플래시 ERG로부터 추출 두 유용한 대책 감광체 인구가 위험한 점 밝은에 노출, 예를 들면, 감소도 2에 도시 된 전형적인 플래시 응답.와도 1에서와 같이 측정 A- 및 B- 파의 진폭, 아르 빛, 망막 전위도의 모든 구성 요소가 감소된다. 원격 허혈 (RIP)와 같은 신경 개입, A-와 B 파 (그림 3)의 진폭의 보존에 의해 검증 될 수있다. 요약하면, ERG의 분석은 건강 손상 가볍고 neuroprotected 망막 간의 비교를 가능하게한다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 시드니 대학의 동물 관리 가이드 라인을 따른다.

1. 만들기 전극

  1. 양극 백금 와이어 직경 1-2mm의 짧은 (5cm) 길이에서 (각막 연락을 드릴 것 하나)를 구축합니다. 루프에 직경이 수 mm 그것을 패션. 앰프의 입력단에 도달하도록 충분한 시간, 통상의 리드에 연결이 루프 (도 4 참조).
  2. AG / AgCl을 또한 컨벤션 리드에 연결된 직경 1-2mm를, 펠렛 사용 (동물의 입에 갈 것입니다) 음극를 구축합니다 (그림 4 참조).
  3. (동물의 엉덩이에 들어갈 것) 기준 전극은, 또한 적당한 길이의 리드에 접속 깨끗한 피하 주사 바늘 (23 G)를 사용함에 따라 (도 4 참조).
  4. 이상적으로, (양의 U를 세 개의 전극을 연결, 기기 제조업체가 제공하는 세 개의 핀 케이블을 사용(94); 각막, 부정 → 입, 앰프 엉덩이 → 참조).

가벼운 자극 및 망막 전위도 셋업 2. 연결 및 교정

  1. 어두운 할 수있는 작은 기록 실험실을 작성 (또는 위치). 빨간색 만든 이상 - 더 - 벤치 빛 또는 붉은 머리 램프의 한쪽 또는 양쪽에 착용.
  2. 1 룩스를 초과하지 않도록 설치하는 동안 쥐의 눈에 도달하는 붉은 빛의 조도를 확인하기 위해 럭스 미터를 사용합니다.
    주 : 감광 필터는 램프 밝기를 감소시킬 수 있고, 램프의 광원은 특히 적색광을 방출한다. 광원이 낮은 (가시) 파장을 방출하는 경우 다크 적응이 손상됩니다.
  3. (이 종종 불투명 테이프와 지속성을 필요) 기록 실험실을 입력 모든 미광을 봉쇄 이상 들어갈 정도로 큰, 그래서 희미 감광 필터를 (이이 장에서 구입하실 수 있습니다) 준비, 컴퓨터 화면 당신은에있을 것이다 실험실.
    참고 : 길 잃은 빛과화면의 빛이 쥐 눈의 어두운 적응을 침해하기에 충분하다.
  4. 데이터 수집 하드웨어에 앰프를 연결합니다. 앰프에 긍정적, 부정적 기준 리드를 연결합니다. 컴퓨터 및 LED Ganzfeld 전원부 안전하게 접지 전원에 연결되어 있는지 확인.
    참고 : 일부 연구소는 건물 접지에 연결, 접지 포인트를 전문으로; 배수관은 효율적인 대안이다.
  5. 연구 품질 복사계와 LED 광원을 보정합니다. 동물의 눈은 실험 기간 동안 위치 할 때의 위치에 미터의 센서를 고정합니다.
  6. Ganzfeld LED가 깜박 사이의 플래시 에너지, 플래시 지속 시간, 플래시 반복과 시간에 단계적인 증가와 전체 필드 ERG 프로토콜을 실행하는 프로그램은, interstimuls 간격 (ISI) 설정을라고. 예를 들어 전체 필드 프로토콜은 표 1을 참조하십시오.
    참고 : ERG 깜박 반복 희미 깜박에서 증가 풀 필드 b에단계 현명한 방식으로 오른쪽으로 깜박입니다. 트윈 플래시 프로그램은 전체 필드에서 프로토콜에 다음과로드와 콘의 답변 분리 할 수​​ 있습니다.

망막 전위도 실험에 3 일 이전

  1. 어두운 기록하기 전에 12 시간 동안 흰쥐 적응. 이 미광이 제거 된 후, 기록 실험실에서 이렇게하는 것이 편리하다.

에르그 실험의 4 일

  1. 동물이 기록하면서 부드럽게 가열 될 수 있도록 정렬합니다. 우리는 동물의 머리가 Ganzfeld에 항목에 정확한 지점에서 휴식 할 수 있도록 구축 된 빛 금속 플랫폼을 사용합니다. 이 플랫폼은 우리가 물을 욕조에 40 ℃로 예열 물 펌프 통해 붙박이 튜브를 가지고있다.
    주 : 경험이 37 ° C에서 동물의 코어 온도를 유지 보여준다.
  2. 어두운 조건에서 쥐의 무게를. 기록의 무게와 올바른 케타민 (60 ㎎ / ㎏)과 자일 라진을 구성 (5 ㎎ / ㎏) 투여 량. 쥐 세대를 억제TLY 및 복강 마취제를 주입.
  3. 주입 시간이 있습니다. 동물이 의식이되면 (대개 5 분 이내)을 가볍게 반사 반응이 존재하는지, 한 발 패드를 곤란하게하여 마취의 깊이를 확인합니다. 그것은이 반사가 진행하기 전에, 없거나 약한 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
  4. 각막에 proxmethacaine의 단일 아트로핀의 드롭 및 다른를 적용합니다.
  5. 검은 스레드의 10cm 길이를 잘라. 단순한 매듭으로 루프를 확인하고 눈의 적도 위에 루프 슬립. 살짝 조여; 효과는 최소한의 압력으로, 약간 앞으로 안구를 그릴 것입니다. 이 눈꺼풀 분명 각막을 유지합니다.
  6. 적용 카보 머 눈은 각막 표면에 떨어진다. 확인 카보 머 각막 표면에 남아 있고 눈꺼풀이나 얼굴에 유출하지 않습니다.
  7. 가열 플랫폼의 상단에 흡수 침구를 놓습니다.
  8. Ganzfeld의 ​​구멍에 권장되는 장소에 머리를 침대에 위치 쥐.
  9. 삽입 INT직장에 ernal 온도 프로브. 꼬리에 프로브 코드를 테이핑하여 위치에서 안전 온도 프로브.
  10. 피하 뒤쪽 다리에 기준 전극 (23 G 바늘)를 삽입하고, 앰프에 연결합니다.
  11. 안전하게 입에 음극 (AG / AgCl을 펠렛)을 놓습니다. 이 입 밖으로 미끄러지는 것을 방지하기 위해, 안정된 표면에 연결 리드를 부착합니다.
  12. 각막의 중심을 통해 양극을 배치합니다. 미세 조작기를 사용하여 전극이 부드럽게 각막 접촉되도록.
  13. 37.5 ° C - 확인 체온은 37.0이다.
  14. 동물 올바른 위치에 전극이 제자리에되면, 불투명 한 재료로 전체 설치 (Ganzfeld과 동물) 드레이프 (어두운 적응을 유지하기 위해). 우리는 부드러운 검은 천을 사용하십시오.
  15. 미리 수집 샘플링 5 밀리 초와 100-1000 밀리의 수집 시간이 2 kHz 샘플링 레이트로 설정 취득 소프트웨어. 내지 1,000으로 밴드 패스 필터를 설정할Hz에서 그 샘플링을 보장은 플래시 다음 ~ 250 밀리의 기간을 샘플링 트리거됩니다.
  16. 기록 기준선을 확인합니다. 그것은 외부 소음이 없어야하지만, 일부 앰프 소음과 진동 호흡을 보여 주어야한다.
  17. 베이스 라인은 외부 소음을 표시하는 경우, 문제 해결을 시작합니다. 대부분의 문제는 전극의 위치, 또는 접지에 미끄러지 관련이 있습니다. 녹음은 외부 소음의 자유 보장하기 위해 패러데이 케이지를 사용합니다.
  18. 테스트 플래시, 0.4 로그 스코틀랜드 cd.sm -2를 실행합니다. 비슷한 ERG 파형 (2A)가 나타납니다 그림. 0.4 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 플래시 연구실 전형적인 반응에서 (: -474 ± 39 μV와 b 파 : 파 1,512 ± 160 μV, N = 11)입니다.
  19. 어두운 동물 10 분 동안 재 - 적응 허용합니다. 이 기준을 다시 확인이 10 분을 사용하는 것이 편리하다.
  20. 안정적인 신호의 다음과 같은 확인 녹음을 시작합니다.
  21. 기록 세션의 끝에서, 그 본체를 확인 temperatURE 유지 하였다. 전극을 제거합니다. 각막에 카보 머 폴리머를 다시 적용합니다. 이 동물 하우징에 반환하기 전에, 완전히 모바일 및 활성화 될 때까지 동물이 열 패드를 복구 할 수 있습니다.

5. 원격 허혈

  1. 깨어 또는 anesthetised 설치류 중 하나에서 원격 허혈을 수행합니다.
  2. 동물 마취 경우 (위) 가열 플랫폼에 누워 무릎의 명확한 뒷다리의 상단 부분에 혈압계 커프 슬립.
  3. 동물이 처리에 사용되는 경우, 마취없이이 절차를 수행 할 수있다; 이 두 사람이 필요합니다. 한 사람이 부드럽게 동물을 억제하고, 두 번째는 혈압계 커프를 적용하고 혈압계를 운영하고 있습니다.
  4. 깨어 동물, 부드럽게 한 뒷다리 무료로, 동물을 포장 수건의 조각 ~ 15cm X 30-50cm를 사용합니다. 머리가 홀더의 팔과 몸통, 장소 사이에 자리 잡고으로, 왼쪽 팔뚝 (말)에 자사의 뒷면에있는 동물을 놓는다커프는 단지 설명했다.
  5. 커프를 수축 및 공기압 밸브가 폐쇄되어 있는지. anesthetised 동물에서 160 mmHg로에 커프 펌프, 깨어 동물에서 180 mmHg로한다. 이 수축기 혈압 (일반적으로 140 mmHg로 160 mmHg로 각각)를 초과합니다.
  6. 휴대용 펌프를 이용하여, 필요에 따라 이들의 압력을 유지한다.
  7. 허혈 후 예정된 시간 (우리는 5 분 재관류로 구분 5 분의 2주기를 사용), 공기압 밸브를 풀어 커프 압을 수축.
  8. 발바닥에 붙어 피부 온도 프로브 원격 허혈의 효과를 확인한다. 피부 온도는 일반적으로 5 분 이상, 32-30 ° C의에서 떨어지는 재관류에 복구합니다.

6. 가벼운 손상

  1. 쥐가 어두운 적응 하룻밤 전에 가벼운 손상 과정에 있는지 확인하십시오.
  2. (지체없이 우리의 실험에서) 사지 허혈 다음 적절한 시간에, 각 동물은 플렉시 글라스 박스, 위스콘신에 단독으로 배치됩니다바닥 기반의 용기에 번째 물과 음식.
    참고 : 빛에 의한 손상은 흰둥이 동물에서 수행 할 수 있습니다.
  3. 표준 시간 (보통 오전 9시)에서 미리 교정 1,000 룩스 흰색 빛에 전환하고 24 시간 동안이 상태를 유지한다.

7. 망막 전위도 데이터 추출 및 분석

  1. ERG의 평균 웨이브 폼을 획득. 감산하여, 비 - 제로 기준에 대한 정확한 필요한 경우.
  2. 기준선과 제 사이의 전압 차이로서, (높은 자극 강도에 중간에서 발표) 파의 진폭을 측정한다 (<30 밀리 초 지연) 트로프 (도 1).
  3. 일반적으로 80-100 밀리 (도 1)의 지연 시간에 발생하는 파장의 피크 파장은 다음의 양극 사이의 전압 차이와 같은 B 파 진폭을 측정한다.
  4. 90 Hz의 전이 대역으로 60-235 Hz의 데이터를 필터링하는 푸리에 변환을 이용하여 진동을 격리 전위 7. 필요한 절연 진동 전위 신호는 필터링되지 않은 파형으로부터 감산 될 수있는 경우 파 물마루의 ID를 확인한다.
  5. A-와 B 파 피크의 암시 적 시간 (대기 시간)도 유용한 측정 (그림 1)이 될 수 있습니다. 로드 응답을 분리하는 트윈 깜박을 사용합니다. 혼합 응답 (플래시 1)로드 응답을 분리하기 (그림 2)에서 콘 응답 (플래시 2)를 뺍니다.
  6. 각각의 광 강도에게 파 및 b 파의 진폭 (후 처리 / 후 처리-기준)을 정상화 또는 치료 그룹에 대한 평균. 강도 - 반응 곡선은 플래시 에너지 대 그룹 진폭 및 에러 플롯.

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결과

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프로토콜은 생체 내 쥐의 망막 시각 기능을 측정 할 수있다. 전파, 광 수용체의 기능을 측정하고, B-파도 내측 망막 기능의 측정은,도 1에 주석 첨부된다.

도 2a에 도시 된 바와 같이 증가하는 빛 자극과로드 지배 ERG 신호 증가. 파장이 0.4 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 2.5 로그 스코틀랜드의 cd.sm에서 포화 될 때까지 파의 진폭이 증가 -2 (미도시)에서 ~ 명백해진다. 트윈 플래시 패러다임은도 2b에서와 같이, 콘 및로드 단리 응답 혼입 ERG 신호를 분리하는데 사용되어왔다.

이 에르그 기록 기술은 신경 개입을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 기준 기록은 빛 손상 이전에이 그림 3a에 볼 수 있습니다 일주일에 완료했다.

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토론

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위에서 설명한 어두운 적응 플래시 에르그 방법은 쥐의 망막 기능을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법이다. 파 및 b 파 모두 빛의 손상에 의해 감소​​되었다. 원격 허혈 양상은 파 및 b 파의 광 손상에 의한 감소를 완화. 망막 기능이 보존 원격 허혈 양상은 저산소증, 허혈 및 운동 8-10으로 보호 전처리의 다른 형태를 닮은 신경을 유도 것을 제안합니다. 녹화 설정, 광 자극의 파라​​미터, 및 동물의 상태 - 기록 ERG 신호는 세 세트의 요인에 의해 결정된다.

녹화 설정

전극이 잘못 배치되는 경우 ERG는 진폭이 감소 또는 제조가 불완전 11 접지된다. 주변 전기 장치의 접지 상태가 기록 노이즈를 줄이기 위해 중요하다; 큰 소음은 패러 드를 계속하는 경우님 케이지를 사용할 필요가 있습니다. 정극 확실 ERG 전체 필드 프로토콜을 시작하기 전에 완료 될 때 체크 및 위치 확인과 각막의 중앙...

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공개 사항

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조나단 스톤 CSCM Pty 주식 회사의 이사

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 설치류 모니터링, 처리 및 실험에서 부인 샤론 SPANA의 도움에 감사합니다. 박사 자금 지원은 비전에서 우수 시드니 대학과 호주 연구 센터에 의해 제공되고있다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PC 컴퓨터
Powerlab, 4 채널 수집 하드웨어AD 기기PL 35044ERG
동물 바이오 앰프인수 AD 기기FE 136ERG
용 증폭기 실험실 차트광고 기기신호 수집 소프트웨어
Ganzfield광도 솔루션FS-250A광 자극
Ganzfield 운영 체제광도 측정 솔루션
연구 복사계국제 조명 기술ILT-1700보정 광 시리즈
럭스 미터LX-1010B체크 레드 라이트 illumanation
엑셀마이크로 소프트
리드선광고 악기연결 포지티브, 네거티브 증폭기 리드선에 접지 전극
- AlligatorAD Instruments접지 간즈필드 및 인수 하드웨어에 컴퓨터
백금 와이어 95%A& E 금속포지티브 전극
입 전극 Ag / AgCl 펠렛SDRE205음극 electode
26 G 바늘BD접지 electode
워터 펌프
수조
튜브
유연한 프로브가있는 동종 담요 시스템Harvard Appartus507222F
아트로핀 1% w/vBausch & Lomb국소 산동증
Proxmethycaine 0.5% w/vBausch & Lomb국소 마취제
Visco 눈물 안약Novartis카보머 폴리머
스레드수축 눈 뚜껑
핀셋
재사용 가능한 접착제Blu tac희미한 빨간색 헤드 램프. 부착 전극
흡수성 침구
Ketamil - 케타민 100 mg/ml - 50 mlTroy Laboratories Pty Ltd해리성
자일륨 - 자일라진 100 mg/ml - 50 mlTroy Laboratories Pty Ltd근육 이완제
스케일

참고문헌

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ElectroretinogramRetinal FunctionRemote Ischemic PreconditioningDark Adapted ERGA Wave B WaveKetamine Xylazine AnesthesiaGanzfeld StimulationCorneal Electrode PlacementLight Damage ModelPhotoreceptor Response Assessment

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