우리는 미세 조작 및 전기 망막검사 기술을 사용하여 제브라피시 유충의 전기망막검사(ERG) 분석 방법을 제시합니다. 이것은 생체 내에서 제브라피시 유충의 시각 기능을 분석하는 간단하고 간단한 방법입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
전위도 (ERG)은 망막의 기능을 결정하기위한 비 침습적 전기 생리 학적 방법이다. 각막의 표면에 전극의 배치를 통해, 전기적 활성도를 측정하여 생체 내에서 망막 세포의 활성을 평가하기 위해 사용할 수있는 광에 응답하여 생성. 이 원고 지브라 피쉬의 시각 기능을 측정 ERG의 사용을 설명한다. Zebrafish의 긴 인해 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 및 약리학 적 유전자 조작에 의한 억제의 용이함 척추 개발을위한 모델로서 이용되어왔다. 5-10 DPF에서, 만 콘 애벌레 망막 기능입니다. 따라서, 제브라 피쉬는 다른 동물과 달리, 생체 내에서 콘 시각 기능의 연구를위한 모델 강력한 시스템이다. 이 프로토콜은 표준 마취, 미세 조작 및 제브라 피쉬의 연구를 수행 실험실에서 흔히 실체 현미경 프로토콜을 사용합니다. 설명 방법은 표준 전기 생리학 EQ를 사용합니다uipment과 저조도 카메라는 애벌레 각막에 기록 미세 전극의 위치를 안내합니다. 마지막으로, 우리는 원래 쥐와 함께 사용하도록 설계된 시판 ERG 자극기 / 레코더 쉽게 지브라 피쉬 함께 사용하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 애벌레 제브라 피쉬의 ERG는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 주입에 의해 수정 된 동물에서 콘 시각 기능을 분석의 우수한 방법뿐만 아니라 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 같은 새로운 게놈 엔지니어링 기술을 제공, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 정기적으로 클러스터 Interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 크게 효율성과 제브라 피쉬에서 대상 유전자의 효능을 증가 모두 Cas9. 또한, 우리는 광 응답에 기여하는 분자 성분을 평가하기 지브라 피쉬 유충 침투되는 약물의 능력을 이용한다. 이 프로토콜은 변형 된 연구자에 의해 사용될 수있는 설정을 간략다양한 실험 목표.
서론
전위도 (ERG)은 인간의 망막 기능을 결정하기위한 임상에서 널리 사용되어 전기 생리 비 침습적 방법이다. 광 자극에 응답하여 전기적 활성도는 각막의 외부면에 기록 전극을 배치하여 측정된다. 자극 패러다임과 응답 파형의 특성이 반응에 기여하는 망막 신경 세포를 정의한다. 이 방법은 마우스와 관상어 동물 모델의 수와 함께 사용하도록되어왔다. 일반적인 척추 ERG 응답은 네 개의 주 성분 갖는다 : 시각 세포 유래의 활성 각막 마이너스 전위 파형 발생기; B-파도 극세포 ON으로부터 유도 각막 양의 전위; D-파도 OFF 쌍극 세포의 활동으로 해석 각막 양의 전위; 와 B 파 후 몇 초 발생하고 C-파, 뮐러 아교 세포와 RET 활동을 반영원고 판 색소 상피 1-4. 인간과 모델 동물에서 ERG 분석의 역사와 원리를 이해하기위한 추가 참조는 원칙과 비전 4, 5의 임상 전기 생리학의 연습으로 유타와 텍스트의 대학에서 온라인 교과서, WebVision을이다.
다니오의 레 리오 (rerio) (제브라 피쉬)는 긴 인해 기관 시스템, 행동 분석의 비 침습적 인 형태 학적 분석과 순방향 및 역방향 유전 화면 (검토를 위해, Fadool과를 볼 수 있습니다 급속한 성숙과 투명성에, 척추 개발을위한....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동물 보수 및 실험 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물 복지의 NIH 사무실과 평가 및 실험 동물 관리 국제 인증 협회의 모든 요구 사항을 충족했다.
참고 : 표준 제브라 피쉬 사육 및 유지 보수 ERG 분석을위한 유충을 얻으려면, 출판 프로토콜 18을 사용 하였다. 애벌레는 자연 번식을 통해 구입해야하며 14 시간 조명 / 10 시간 어두운주기에 따라 보관되어 있습니다. 이 프로토콜은 포스트 수정 (DPF) 5-7일에서 유충에 최적화 된,하지만 이상적 절차에 작은 수정을 오래된 생선을 수행 할 수 있습니다. 여기, 5 DPF에서 야생 형 제브라 피쉬 애벌레의 TL 균주를 사용합니다.
1. 마이크로 피펫 생산
- 화재 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 0.86 mm (내경에 의해 외경)를 사용하여 여러 개의 마이크로 피펫을 당겨필라멘트 (821 ° C, 용융 온도)와 P-97 불타는 / 브라운 마이크로 피펫 풀러 상자 열 필라멘트를 장착. 표 1에 설명 된 마이크로 피펫을 도운에 대한 프로그램을 사용하십시오.
- 팁 직경이 10 ~ 15 μm의 것을 보장하기 위해 적절한 계수 선 통치자와 현미경 각 마이크로 피펫을 확....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
일반적으로, 망막 전위는 많은 연구가이 단계 9, 16, 20에서 ERG 녹음을 게시 한 이후, 5 DPF에서 zebrafish의 유충으로 기록됩니다. 유생 응답은 백색 LED 광의 20msec의 자극을 이용하여 설정된 배경 조명 암순응 조건으로 측정 하였다. 우리 Ganzfeld 광 자극기 및 컴퓨터 제어기 / 레코더 이루어진 시판 ERG 시스템을 이용했다. 자극기는 배경 및 플래시 자극 모두의 휘도를 제어하는 고유 엄격하게 제어 펄스 폭 변조 (PWM) 시스템을 사용한다. 응답은 디지털 변환기 (ADC)에 대한 16 비트 아날로그 구동 하드웨어 안티 앨리어싱 필터와 독점적 완전 차동 증폭기를 사용하여 기록 하였다. 자극 및 응답 녹음하여 제조사의 프로토콜에 따라 기기에 포함 된 전용 소프트웨어에 의해 제어되었다. 우리의 장비는 1 kHz의 샘플링 레이트를 이용하도록 프로그램 된 디지털 베셀 CASC에이드 필터는 0.312 Hz에서 300 Hz에서, 과도한 노이즈를 제거하기위한 60 Hz에서 노치 필터.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서 애벌레 제브라 피쉬의 ERG 녹음에 대한 간단한 절차를 자세히 설명되어 있습니다. 명심해야한다 절차를 통해 몇 가지 중요한 단계는이 절차는 시각 function.There의 신속하고 종합적인 분석이 가능하다. 실험이 잠재적 인 약물 치료 중에 죽음을 방지하고 ERG 녹음 중에 장시간 생활을 보장하기 위해 전에 제브라 피쉬의 유충이 건강해야합니다. 또한, 실험에 이용 유충 밀접 연령대 것이 중요하다. 이는 망막 (콘 아형, 즉 차동 개발), 또한 유생의 전체적인 형태 및 생리 급속한 발전이다. 예를 들어, 상피 증산 효율 DPF 7 후에 더 어렵게 살아 물고기를 유지하게 감소한다. 또 다른 중요한 요소는 기록 전극과 기준 전극의 품질이다. 거친 가장자리 t을 방지하기 위해 유리 모세관을 당겨 때주의가 필요하다IPS. 마이크로 피펫 microforge는 신호 수집을 개선하기 위해 전극과 도움을 뽑아 불 닦으에 사용될 수있다. 또한 자세 / AgCl을 전극의 품질을 유지하는 것은 매우 중요하다. 사용.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
제브라피쉬를 유지해 주신 UNC 제브라피시 양식 시설 구성원들에게 감사드립니다. 또한 ERG 장치 설정에 도움을 주신 Diagnosys, LLC에 감사드립니다. 전기생리학적 방법에 대한 도움을 주신 Portia McCoy 박사와 Ben Philpot 박사의 실험실에 감사드립니다. 우리는 또한 애벌레 제브라피쉬의 삽화에 대해 Lizzy Griffiths에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 수여하는 F32 EY022279(J.D.C) 및 R21 EY019758(E.R.W)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 패러데이 케이지 | 80/20 Inc | 맞춤형 | 맞춤형 알루미늄 "산업용 이렉터 세트" 케이지 프레임워크 |
| PVA 스폰지 | 아마존 | B000ZOWG1C | 제브라피쉬 유충 배치를 위한 부드럽고 촉촉한 플랫폼 제공 |
| 150ml 멸균 필터 시스템 | Corning | 431154 | 필터링 솔루션은 작은 관절이 마이크로피펫을 차단하는 것을 방지합니다. |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | 연락처 | 모든 자극기에 대한 시각적 자극을 생성하고 고유 소프트웨어를 사용하여 반응의 디지털 기록 및 분석을 수행할 수 있는 모듈식 전기 생리학 시스템, 자세한 내용은 |
| http://www.diagnosysllc.com Colordome | Diagnosys, LLC | Ganzfeld ERG용 RGB LED 및 크세논 광원이 있는 접촉 광 자극기, http://www.diagnosysllc.com | |
| Micromanipulator에 대한 자세한 정보 | Drummond | 3-000-024-R | 기록 미세 전극 |
| 자기 링 스탠드 | 및 위치 지정 Drummond | 3-000-025-MB | 카메라 및 굴절 전극 고정 및 위치 |
| 지정 리드 확장 | Grass Technologies | F-LX | 전극 연결용 예비 암-수 1.5mm 리드 케이블 |
| - 암 SAFELEAD 어댑터 | Grass Technologies | DF-215/10 | 2mm 핀을 1.5 헤드보드 핀에 연결 |
| 윈도우 스크린 프레임(금속) 및 스플라인 | Lowes 또는 Home Depot | 다양한 | 패러데이 케이지 프레임워크에 구리 메쉬 부착용 |
| Steriflip 50ml 필터 | Millipore | SCGP00525 | 작은 관절이 마이크로피펫을 막는 것을 방지하기 위한 필터링 솔루션 |
| BNC 어댑터 | Monoprice | 4127 | BNC 케이블에 카메라 연결 |
| BNC 케이블 | Monoprice | 626 | 카메라를 비디오 어댑터에 연결 |
| 카메라 렌즈 | Navitar | 1582232 | 유충 각막에 기록 미세 전극의 위치 시각화 |
| 카메라 커플러 | Navitar | 1501149 | 유충 각막에 기록 미세 전극의 위치 시각화 |
| Luna BNC to VGA + HDMI 변환기 | Sewell | SW-29297-PRO | BNC-VGA 어댑터는 카메라 이미지를 컴퓨터 모니터에 투사할 수 있게 해주며 |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 작용제, b-wave를 차단하여 고립된 원뿔 질량 수용체 전위를 분석할 수 있게 해줍니다. |
| 보로실리케이트 유리 | Sutter | BF-150-86-10 | 파이어폴리싱 붕규산 유리 (측정 온도 = 821°C; C) 필라멘트 및 1.5mm x 0.86mm(내경 기준 외경)의 치수 |
| P97 화염 / 갈색 풀러 | Sutter | P97 | 유리 마이크로 피펫 당기기 용 |
| Sorbothane 시트 | Thorlabs | SB12A | 충격을 흡수하고 미끄러짐을 방지하기 위해 수동 격리 마운트 및 ERG 플랫폼 아래에 배치 된 합성 점탄성 우레탄 폴리머는 |
| ERG 자극기 및 제브라 피쉬 표본 | |||
| 수동 격리 마운트 | Thorlabs | PWA074 | 브레드 보드에 진동 차단 제공 |
| 구리 메쉬 | TWP | 022X022C0150W36T | 패러데이 케이지 |
| 피펫 펌프 | VWR | 53502-233 | 파스퇴르 피펫과 함께 사용하여 제브라 피쉬 유충을 조심스럽게 이송 |
| 파스 | VWR | 14672-608 | 피펫 펌프와 함께 사용하여 제브라 피시 유충을 조심스럽게 이송합니다 |
| Camera | Watec | WAT-902B | 유충 각막에 기록 미세전극의 위치 시각화 |
| 트리카인(MS-222), | 웨스턴 케미컬 | 트리카인-S | , 제약 등급 마취제, |
| Micro-fil | WPI MF28G-5 | 충전 미세전극 홀더 및 미세전극 유리 | |
| 미세전극 홀더 | WPI | MEH2SW15 | 유리 미세 전극을 잡고 ERG 장비 |
| 참조 전극 | WPI | DRIREF-5SH | 케이싱의 마지막 센티미터를 조심스럽게 분리하여 전해질을 배출하고 소결 Ag/AgCl 펠릿 전극 |
| 참조 전극(대안) | WPI EP1 | DRIREF-5SH의 대안을 노출시킵니다. 연결 리드에 배선/납땜해야 하는 Ag/AgCl 전극 | |
| WPI | 13620 | 용 저소음 케이블 | 녹음 마이크로 전극 홀더를 어댑터/헤드보드에 연결 |
참고문헌
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
