마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

Summary

이 프로토콜은 마우스의 일시적인 중대뇌동맥 폐색 후 경색 부피와 혈액-뇌 장벽 파괴를 감소시키는 반복적인 저산소증 전조건화 또는 전신 저산소증에 대한 짧은 노출을 설명합니다. 또한 신경혈관 보호의 효능을 평가하기 위해 뇌졸중 후 경색 용적과 혈액-뇌 장벽 파괴의 이중 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

뇌졸중의 실험 동물 모델은 스트로크의 병리를 이해하고보다 효과적인 치료 전략을 개발하기위한 매우 중요한 도구입니다. 반복적 저산소 전처리 (RHP) 대 이주 프로토콜 국소 허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 중추 신경계 (CNS) 상해에 대하여 장기간 보호를 유도한다. 우완 두 기간 (2 ~ 4 시간)와 강도 (8 %와 11 % O _2)에 따라 다릅니다 저산소증 9 확률 적 노출로 구성되어 있습니다. 우완는 내인성 중추 신경계 보호 표현형의 장기 유도를 제안, 경색 볼륨, 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​ 중단 및 저산소증에 마지막 노출 다음 주 이후 행정 염증 반응을 감소시킨다. 경색 볼륨 및 BBB 중단의 이중 정량 방법은 우완 또는 다른 추정 neuroprotectants와 생쥐의 신경 혈관 보호 기능을 평가하는데 효과적이다. 성인 남성 스위스 웹스터 마우스는 21 % O로 우완 또는 기간 - 상응하는 노출에 의해 미리 조정했다 (즉, 실내 공기). 60 분 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 (결과 tMCAO)은 최종 저산소 노출 다음 이주을 유도 하였다. 폐쇄 및 재관류 모두 두개 레이저 도플러 flowmetry에 의해 확인되었다. 재관류 후 스물 두 시간, 에반스 블루 (EB)를 정맥 꼬리 정맥 주사를 통해 투여 하였다. 2 시간 후, 동물을 이소 플루 란과 과량 뇌 섹션에 의해 희생시켰다은 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC)로 염색 하였다. 경색 볼륨은 정량 하였다. 다음으로, EB는 결과 tMCAO 후 BBB 중단을 결정하기 위해 48 시간 동안 조직으로부터 추출 하였다. 요약하면, RHP 다른 CNS 기반 및 전신성 염증성 질환 상태에 대한 병진 전위, 마우스에서 스트로크 부상 장기 내인성 신경 혈관 보호를 유도하기 위해, 최소한의 비용으로 복제 할 수있는 단순한 프로토콜이다.

Introduction

성인 장애와 사망의 네 번째 주요 원인의 주요 원인으로, 뇌졸중은 미국의 성인 인구가 직면 한 가장 쇠약 질병 상태 중 하나입니다. 뇌졸중의 ¹ 동물 모델은 허혈 손상을 감소시키는 새로운 방법과 실험 조사 허용 졸중 회복을 개선시킨다. 등의 중개 연구에 대한 하나의 새로운 길을 사전 조정된다. 전처리는 후속하는, 더 심한 부상으로부터 손상을 줄이기 위해 비 손상 자극의 의도적 인 ^{사용이다.이} 저산소 전처리는 생체 내 및 시험 관내 연구에서 모두 스트로크에 대한 보호를 제공하는 뇌의다면 발현 변화를 생성하는 것으로 나타났다 . ⁽³⁾ 그러나, 저산소증에 하나의 노출은 성인 쥐에서 허혈에 대한 허용 오차 미만의 72 시간을 유도, 단기 신경을 제공합니다., 린 등 기압 성 저산소증에 14 시간 매일 노출의 ^4도 네 후 주. FO싶게 그 신경은 일주. ⁵ 반복 저산소 전처리 (RHP) 지속 하였다는 주파수, 기간, 저산소 노출의 강도의 확률 적 변화에 의해 특징입니다. 단일 전처리 도전 달리 RHP 쥐 여덟 주까지 지속 cerebroprotective 표현형을 유도한다. ⁶ RHP 최종 저산소 노출 후 주 경색 부피, 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) ....

Protocol

참고 :이 프로토콜은 실험 동물 사용에 대한 건강 (NIH) 정책에 대한 국립 연구소 준수 UT 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 반복 저산소 전처리

1. 사용자 정의 디자인 사 가스 규제에 유량계와 (O ₂₎ 탱크 입구 포트를 통해 챔버로 유입 산소로부터 압축 가스를 할 수 있도록 PVC 튜브 표준 15 패 유도 챔버에 연결합니다. 사용자 정의 디자인에 대한 자세한 내용은 장비 및 재료를 참조하십시오.
2. 8 %와 11 % O _2에 노출을받을 반복 저산소 전처리 (RHP) 그룹, 및 제어 그룹, 동시에 21 % O ₂ (실내 공기)에 노출을받을 : 2 그룹으로 마우스를 나눈다. 주파수의 변화는 표 1을 참조 강도 (8, 11 % O _2, 21 % O ₂₎ RHP 노광의 지속 시간 (2 또는 4 시간).
3. 각각의 O ₂ 탱크에 연결된 실에 그대로 음식과 물 병, 각 케이지의 상단 필터 덮개를 제거하고 케이지를 놓습니다. 닫고 실의 덮개를 고정.
   1. 탱크의 메인 가스 밸브를 ....

Results

이 연구는 연령 10 주 우완으로 무작위 배정의 시작에 있었다 (N = 10) (25) 남성 스위스 웹스터 마우스 또는 21 % O ₂ (N = 15) 그룹을 포함. 2 주 최종 우완 노출 후, 수술은 눈을 멀게 그룹으로 수행하고 일 사이에 카운터. 결과 tMCAO 다음, 1 마우스는 수술 후 회복 중 사망하고 재관류 CBF 기준을 충족하지 않았기 때문에 1 마우스는 연구에서 제외되었다. 모두 제외 마우스는 21 % O ₂ 군에서 있었다. 에 따라 지침 도착, ²⁸ 표 2는 수술 매개 변수를 보여줍니다. 간접 경색 볼륨, 반구 부종 (즉, 부종), 그리고 에반스 블루 (EB) extravasations는 모든 데이터가 짝 T-테스트 (평균, 표준 편차가 표시)로 분석 하였다. 그림 2에 표시되며, 아웃 라이어는 거짓 검색 속도 검출 4 이상 값을 제거 1 % (을 Graphpad 프리즘), 이하 (2 21 %, RHP 2).......

Discussion

전신 저산소증 마우스 (즉, 2 시간 11 % O _2)에 하나의 노출은 "일시적으로"짧은 지속되는 저산소 전처리 도전에 후생 유전 학적 반응을 의미하는 결과 tMCAO, ^{29 일부터} 뇌를 보호하고, 기준 표현형 내에서 복원 일. 저산소 전처리 자극의 반복 프리젠 테이션은 크게 신경 표현형의 기간을 연장. ⁶ 많은 연구는 반복적 인 자극 열차의 빈도, 규모 및 기간이 응답의 중요한 결정 요인이라는 것을 보여 주었다. 예를 들어, 단순히 동일한 강도 및 저산소증의 지속 시간 (2 시간 11 % 산소) 주당 3 회 (MWF)이 2 이상의 결과 tMCAO ^6에서 신경 혈관 보호를위한 치료 창을 확장하지 않은 주 그러나이 장기 유도하기에 충분 하였다 반복 망막 용어 허혈성 허용. ⁽³⁰⁾ 흥미롭게도, 비록 전신 저산소증 (5 노출 5 시간 8 % O _{2 <}/ 서브>) 5 저산.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
유량계, 레귤레이터	VetEquip, Inc	Specialty 주문	4 개의 유량계가 6.0mm 플렉시블 PVC 튜브에 부착되어 플라스틱 암 커넥터로 각 유도 챔버의 입구 포트에 연결됩니다. 이 유량계는 6.5" x 1" x 1" 금속 막대에 볼트로 고정되어 있습니다. 이 금속 막대는 DISS 배출구가 있는 MI-246-P 압력 게이지에 볼트로 고정되어 있습니다. 이 압력계 및 유량계 장비는 렌치를 사용하여 각각의 새로운 가스 실린더에 부착할 수 있습니다.
21% O2 탱크	AirGas	OX USP200
11% O2 tank	AirGas	특수 주문
8% O2 tank	AirGas	특수 주문
15 L 유도 챔버	VetEquip	941454
Moor Laber Dopper Flow	무어 악기	moorVMS-LDF1-HP	0.8 mm 직경 프로브
고강도 조명기	Nikon	NI-150
줌 스테레오 현미경	NIkon	SMZ800	다른 수술용 현미경을 사용할 수 있습니다.
Kent Scientific Right Temperature CODA	Kent Scientific Corporation	단종	권장 대체품은 RightTemp 온도 모니터링 및 항상열 제어 기능이 있는 PhysioSuite(Kent Scientific, #PS-RT)입니다.
Hovabator 인큐베이터	Stromberg의	2362-E	우리의 모델은 2362N입니다. 2362E는 나중 모델이며 전자 온도조절기가 포함되어 있습니다.
V010 마취 시스템	VetEquip	901807	포함: 10피트 고압 산소 호스, 프레임, 유량계, 산소 플러시 어셈블리, 기화기, 호흡 회로, 챔버, 노즈콘, 폐기물 가스 배출 튜브 및 두 개의 VapoGuard 필터
250 ml 이소플루란	버틀러 샤인	NDC-11695
D-6 수의사 트림 동물 무선 트리머	안디스	#23905	교체용 칼날은 Andis (#23995)
Betadine 에서	피셔 사이언티픽	19-898-867
Q-tips	여러 판매자	카탈로그 번호를 사용할 수 없음
거즈 패드	Fisher Scientific	67622
수술용 드레이프	Fisher Scientific	GM300
실크 봉합사	Look/Div Surgical Specialties	SP115
나일론 봉합	Look/Div Surgical Specialties	SP185
Durmont #5 forceps (2)	고급 과학 도구	11251-35	각도 45°
수술용 가위	파인 사이언스 도구	14028-10
3mm Vannas	Kent Scientific Corporation	INS600177	직선 블레이드
Hartman Hemostats	Fine Scientific Tools	13002-10
오클루딩 필라멘트	워싱턴 대학교	전문 주문	필라멘트는 워싱턴 대학교에서 실리콘 코팅되어 UTSW 시설에 유료로 제공됩니다.
Evans Blue	Sigma Aldritch	E2129-10G
여과지	Sigma Aldritch	WHA1001150	150mm, 원, 1등급
무게 보트	Fisher Scientific	02-202-101	2.5" 직경
0.9% 염화나트륨 주입 USP	박스터 제약	2B1321
0.3 cc 인슐린 주사기와 29 게이지 바늘	Becton Dickinson Labware	309301
평평한 바닥 재조정기	브레인트리 사이언티픽	페이스북  M	2.0" 직경
TTC	Sigma	T8877
10x PBS, pH 7.4	Fisher Scientific	BP399-20
수조	다수 판매자	카탈로그 번호를 사용할 수 없음	TTC가 있는 섬광 튜브는 수조 대신 흐르는 따뜻한 물에 수동으로 고정할 수 있습니다.
스티로폼 보드	여러 판매자	카탈로그 번호를 사용할 수 없음
대형 주사기	키트 펌프시스템 Inc	P-SYRKIT-LG
관류 펌프	펌프시스템 Inc	NE-300
60cc 주사기	Fisher Scientific	NC9203256
27 게이지 날개 주입 세트	Kawasumi Laboratories, Inc	D3K1-25G 1
20ml 섬광 바이알	Fisher Scientific	50-367-126
스테인리스 스틸 주걱	Fisher Scientific	14-373-25A
알토 아크릴 1.0mm 마우스 뇌, 관상	CellPoint 과학적	카탈로그 번호를 사용할 수 없음
0.21mm 스테인리스 스틸 블레이드, 25pk	CellPoint Scientific	카탈로그 번호를 사용할 수 없음	재사용 가능한 저온 유지 장치 블레이드는 저렴한 대안입니다.
4% 파라포름알데히드	산타크루즈 생명공학	SC-281692
Superfrost 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-15
HP Scanjet G4050	다중 판매자	카탈로그 번호를 사용할 수 없음	다른 상용 스캐너는 프로토콜의 이 단계에 적합합니다.
이미지J	National Institute of Health	카탈로그 번호를 사용할 수 없음
분석 저울	Mettler Toledo	XSE 205U
정밀 소형 오븐	써모 사이언티픽
1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브(Eppendorfs)	Denville Scientific	C2170
포름아미드	Fisher Scientific	BP228-100
96-웰 플레이트	Fisher Scientific	07-200-9
Epoch 마이크로플레이트 분광광도계	바이오텍	카탈로그 번호를 사용할 수 없음