방법 논문

에탄올 진정 감도 및 신속한 공차 측정을위한 저렴하고 확장 가능한 행동 분석

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DOI:

10.3791/52676

⸱

2015년 4월 15일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

초파리에서 에탄올 민감도와 빠른 내성을 측정하기 위한 간단한 분석은 이러한 중요한 에탄올 관련 행동을 조사하기 위해 이 모델 유기체의 사용을 용이하게 합니다. 여기에서는 파리의 에탄올 감도와 빠른 내성을 측정하기 위한 비교적 간단하고 확장 가능한 분석법이 설명됩니다.

초록

알코올 사용 장애 (AUD)는 건강에 심각한 도전이다. AUD로 큰 유전 요소에도 불구하고, 몇 가지 유전자는 분명하게 자신의 원인에 연루되어있다. 초파리, 초파리 melanogaster의는 알코올과 관련된 행동의 기초 분자 유전 메커니즘을 탐구하기위한 강력한 모델이므로 확인하고 AUD에 영향을 미치는 유전자의 기능을 이해하는 데 큰 약속을 보유하고있다. 이러한 유형의 연구를위한 모델 초파리의 사용은 안정적 에탄올 행동 반응을 측정하는 분석법의 가용성에 의존한다. 이 보고서는 파리에서 에탄올 감도와 빠른 내성을 평가하기위한 적절한 분석을 설명합니다. 이 분석에서 측정 에탄올 감도가 초파리 시험 직전 음식없이 수납되어 사용되는 부피의 에탄올 농도, 이전에보고 된 유전자 조작의 다양하고, 또한 시간의 길이에 의해 영향을 받는다. 한편, 에탄올 S이 분석에서 측정 ensitivity 플라이 처리, 파리의 성별, 항생제 또는 살아있는 효모와 성장 매체의 보충의 활력에 영향을받지 않습니다. 정량 에탄올 감도 세 가지 방법은 모두 본질적으로 구별 에탄올 감도 결과에 선도적 인 기술되어있다. 전반적인 단순 결합이 분석의 확장 성 성격, 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 업을 설정 초파리 에탄올 감도와 빠른 관용의 크고 작은 규모의 유전 적 분석에 적합하게합니다.

서론

알코올 사용 장애 (AUD)는 전 세계적으로 (1 검토) 거대한 건강 문제입니다. AUD의 개발 구동 메커니즘 복잡하지만, 이러한 장애는 유전 주요 구성 요소를 가지고 (예를 들어, 2). AUD 및 보존 행동 반응의 대형 유전은 더 나은의 분자 기초를 이해하는 방향으로 에탄올과 관련된 행동의 특정 유전자의 참여를 조사하기 위해 유전자 모델 생물을 사용하여 강한 관심을 생성 한 (3,4 검토) 많은 종에서 에탄올 AUD. 초파리, 초파리 melanogaster의는 (3,4 검토) 에탄올과 관련된 행동의 분자 유전 학적 메커니즘을 탐험을위한 선도적 인 모델 생물로 떠오르고있다. 파리의 연구 (5 검토) 에탄올 행동 반응의 여러 신호 전달 경로에 대한 역할을 강조했다. 흥미롭게도, 유전자 및 경로의 일부 행동 응 답에 영향을 미치는 그파리에서 에탄올 ES는 또한 설치류 에탄올과 관련된 행동 및 / 또는 인간 AUD (예 : 6-14)에 연루되어있다. 초파리 모델 시스템에서 사용할 수있는 유전 적 도구의 스위트 룸과 함께 종에서 에탄올과 관련된 행동을, 구동 메커니즘의 보존, 에탄올 행동 반응의 유전학을 조사를 위해 초파리 모델의 유틸리티를 강조한다.

감도 (15, 16)과 인간에 에탄올 (17에서 검토) 허용 오차는 AUD의 발전에 연결되어 있습니다. 에탄올 이러한 행동 반응은 모두 (3,4 검토) 실험실 분석의 다양한 통해 파리에서 모델링 할 수있다. 저자에게 공지 플라이 분석 모두에서 진정 에탄올 중 시간에 따른 에탄올 - 유도 진정 / 운동 실조 또는 경시에 기초하여 복구된다.

에탄올 감도 및 R의 유전학에 우리 그룹에서 이전 기사에서초파리 APID 공차는, 파리의 에탄올 증기 유도 진정 작용에 기초하여 행동 분석은 (18)을 사용 하였다. 이 분석에서 시험이 라이브 성인 전송함으로써 개시 하였다는 셀룰로오스 아세테이트 플러그의 상부 (즉, 비 - 플라이 측)에 에탄올을 첨가, 셀룰로오스 아세테이트 플러그 바이알에서 파리 트래핑 음식 바이알 비우기 마취없이 날아간 및 실리콘 스토퍼 파리, 셀룰로오스 아세테이트 플러그 및 에탄올을 함유하는 바이알을 밀봉 (18 참조,도에서 개략적 S3 참조). 파리의 상이한 그룹을 나타내는 여러 바이알이 분석의 처리량을 증가 병렬 평가 하였다. 유리 병은 익명의 코드를 부여하고 실험자은 진정 작용의 평가에 의도하지 않은 편견을 방지하기 위해 치료 그룹에 눈을 멀게했다. 표준 실험에서, 바이알에 30 초 복구 후 각 바이알에 진정 파리의 수를 계수하고 converte시키고, 6 분 간격으로 부드럽게 탭핑 하였다 파리%의 활성 파리에 D. 파리 내부 에탄올 18 진정제 (이 보고서의 참조 (18) 및 CF도 1a 및도 1b)에서 점진적인 증가를 일으키는 시간 의존적 방식으로 셀룰로스 아세테이트 플러그에서 에탄올 증기를 흡수. 이 분석에서 진정 운영 체제는 산책을하거나 (II) 또는 날개를 펄럭없이 뒤에 거짓말의 부재에서 파리 (I) 서로 정의 하였다. 여기서, 에탄올이 진정 작용 분석법 상세히 설명에는, 사용과 관련된 추가의 최적화 동작이 제공되며, 분석은 비행 진정 감도 음식 보충 옵션 기여를 해결하기 위해 사용된다.

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프로토콜

분석 전에 1 일

  1. 짧은 (1-5 분) CO 2에서 11 (단일 섹스)의 그룹 신선한 식품 유리 병에 파리를 수집합니다.
  2. 파리는 환경 제어 공간에서 음식을 유리 병에 (일반적으로 25 ° C, 상대 습도 60 %, 12 시간 빛 / 어둠 사이클) O / N을 복구 할 수 있습니다.
  3. 계획된 실험에 적합한 최종 농도 (들)에 정제 (≥18 MΩ) 물에 순수 (100 %) 에탄올을 희석하여 에탄올 용액 (들)을 준비합니다. 솔루션 (들) RT O / N로 복귀 할 수 있습니다.
    참고 : 에탄올의 희석은 발열이다.

분석 2. 일

  1. 파리의 각 바이알을 테스트하려면, 깨끗하고 빈 식품 유리 병을 (i)를 준비; 즉, 검사 바이알 (ⅱ) 새로운 셀룰로오스 아세테이트 플러그, (ⅲ) 실리콘 마개 및 (IV)의 에탄올 용액 (표 3 참조)를 1 ㎖.
  2. 55-65%에 20 ~ 25 ° C의 온도와 상대 습도를 조절하여 테스트 룸을 준비합니다.
  3. 다른 노동자 되세요튜브의 각 그룹에 고유 코드를 할당하고 이후의 코드를 기록합니다. 몇 분 동안 적응 시험 방에 파리 코드화 된 튜브를 놓습니다.
  4. 2.3에서 비행 병에 코드를 일치하도록 빈 테스트 튜브 레이블.
  5. 표 1과 유사한 스프레드 시트의 열로 코드 (하나의 열 / 병)을 입력하여 하드 카피 테스트 로그를 구축합니다.
  6. 가이드로 테스트 로그를 사용하여 테스트 룸에서 배열을 일치로 파리와 빈 테스트 튜브 코드화 된 식품 유리 병을 준비.
    참고 : 테스트하는 튜브의 합리적인 최대 수 (24) (즉, 4 병 각 6 세트).
  7. 전송 일치 / 표시 빈 테스트 튜브로 음식 바이알에서 날아 셀룰로오스 아세테이트 플러그 유리 병 상판 아래 2cm가 될 때까지 즉시 테스트 튜브에 셀룰로오스 아세테이트 플러그를 삽입합니다.
  8. 이하, 엇갈린 1 분 간격으로 집합으로 네 병의 각 행을 처리합니다.
  9. 시간 0 평가의 경우, 개별적으로 w 각각의 유리 병을 파악i 번째 엄지 손가락과 집게 손가락은 유리 병의 바닥에 파리를 노크 30 초를 기다린 후 죽은 / 움직입니다 파리의 수를 계산하기 위해 테이블​​에 부드럽게 세 번 누릅니다. 시간에 하드 카피 테스트 로그에 0 분 각각의 병에 대한 부동 / 죽은 파리의 수를 기록한다.
  10. 타이머는 시간 0에서 연속적으로 카운트 업을 시작하고, 즉시 4 튜브의 첫 번째 행 / 세트 바이알 셀룰로스 아세테이트 플러그에 에탄올 1 ㎖을 첨가 시작한다. 그들은 테스트 할 순서에 5 초 간격으로 바이알에 셀룰로오스 아세테이트 플러그에 에탄올 1 ㎖을 추가한다. 에탄올은 셀룰로오스 아세테이트 플러그 골고루 흡수되도록 원을 그리 셀룰로오스 아세테이트 플러그에 에탄올을 추가합니다. 에탄올은 세트의 모든 4 테스트 튜브에 첨가되었을 때, 그것을 밀봉하는 바이 얼 실리콘 플러그를 삽입한다.
  11. 회 1, 2, 3, 4, 5 분에서, 각각의 튜브 (4) 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 세트에 에탄올 1 ㎖을 추가한다. 후 실리콘 마개를 삽입 계속4 튜브의 각 세트에 에탄올을 추가.
  12. 시간 6 분에서, 엄지와 집게 손가락으로 각 유리 병을 잡고 유리 병의 바닥에 파리를 노크 테이블에 부드럽게 세 번을 눌러, 30 초 대기 후 계산과의 총 수를 기록하여 4 병의 첫 번째 세트를 테스트 진정시켰다 파리. 점수는 (i)는 유리 병의 바닥에 서 있지만, 또는 그들의 날개를 펄럭없이 자신의 허리에 도보 또는 (ⅱ) 거짓말하지 않는 경우 진정으로 날아갑니다.
  13. 표 2의 스케줄을 사용하여 5 초 간격으로 셋 내의 각각의 바이알 핸들.
  14. 제 세트에 대해 수행 배 7, 8, 9, 10 및 11 분에서 각각 튜브의, 제 3, 4, 5, 6 세트를 테스트한다.
  15. 시간이 12 분으로 2.12에 기재된 바와 같이, 튜브 (4)를 다시 상기 제 1 세트의 테스트를 각각 13, 14, 15, 16 및 17 분에서의 바이알 제, 3, 4, 5, 6 세트의 연속 시험.
  16. 모든 파리가들 때까지 2.12에 설명 된대로 테스트 파리 계속edated.
  17. 하드 카피 테스트 로그의 각 유리 병에 파리의 총 수를 입력합니다. 파리의 총 수에서 시간 0에서 움직이지 / 죽은 파리를 검열.
  18. 시간 (x 축) 대 % 활성 파리 (y 축)와 같은 각각의 평가 지점에서의 시간 퍼센트 활성 파리와 플롯 데이터를 계산한다. 다항식 또는 S 자형 곡선이 맞는 3 차에서 진정 작용 시간 (50) 값 (ST50, 50 %의 진정 작용에 시간) 보간 또는 곡선 아래의 면적을 계산하여 에탄올 진정 작용을 정량.
  19. 디코딩 유리 병에서 데이터를 컴파일하고 통계 분석을 수행 (예를 들면, 일원 분산 분석 페로 니 여러 비교 테스트와) 실험 설계에 대한 적절한.

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결과

이 에탄올 진정 작용 분석에서 원시 데이터는 에탄올 증기 노출 시간의 함수로서 진정시켰다 파리의 수이다. 원시 데이터는 시간의 함수로서 파리 퍼센트 활성으로 전환된다 (primary 데이터를도 1A, B, D - F). 곡선 적합로부터 기본 데이터에서 에탄올에 진정 감도 보간을 통해, 진정 작용 시간 50 (ST50)로 곡선 (AUC) 아래 진정제 또는 AEA가 날아간의 50 %에 필요한 시간을 정량화 할 수있다. 이전 (평균 R 2 = 0.934, N = 24, 그림 1A에게) 예상대로 S 자형 곡선이 기본 다소 더 나은 데이터 (평균 R 2 = 0.997, N = 24 맞는 있지만 18 3 차 다항식 곡선, 잘 기본 데이터에 맞게보고; 그림 1B). 곡선 근사화 ST50에서 값을 결정하는 것에 대한 대안으로서, 주 데이터의 에탄올 진정 감도도 영...

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토론

재현성 의미있는 표현형을 정량 간단 분석은 행동의 분석을위한 큰 가치입니다. 여기에 설명 된 작품은 초파리에서 에탄올 진정 감도와 빠른 내성을 측정하기위한 분석의 몇 가지 실용적인 측면을 해결합니다. 이 작품이 아니 긴하지만, 행동 분석 연구에서 피험자에 대한 환경 및 유전 적 배경을 일정하게 유지에 의해 촉진된다. 또한, 비교는 일반적으로 사육과 나란히 테스트 파리의 그룹 사이에해야한다. 이를 위해,이 작품의 개별 실험 내의 모든 파리가 동일한 유전 적 배경을 가지고 균일 한 환경 조건 표준 음식 매체와 (25 ° C, 상대 습도 60 %, 12 시간 빛 / 어둠 사이클)에서 나란히 양육되었다 (10 % 음식 매체가 명시 적으로 조작 된 이들 실험을 제외 크로즈, 3.3 %의 옥수수 가루, 2 % 및 1 % 효모 한천).

ETH여기에 설명 anol 진정 작용 분석은 저렴하고 상업적 공급원 (표 3)으로부터 쉽게 사용할 모두 거의...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 미국 국립 알코올 중독 및 알코올 남용 연구소(National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse)의 보조금으로 지원되었습니다(P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). 저자는 유용한 토론을 해준 Jill Bettinger와 기술 지원을 제공한 Jacqueline DeLoyht에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
식품 바이알VWR89092-772좁은
플러그Genesee/flystuff.com49-102좁은
실리콘 스토퍼Fisher Scientific09-704-1L#4
에탄올Pharmaco-Aaper111000200200 proof

참고문헌

  1. Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
  2. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  4. Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
  5. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
  6. Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
  7. Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
  8. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  9. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
  10. Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
  11. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
  12. Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
  13. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
  14. Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
  15. Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
  16. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  17. Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
  18. Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
  19. Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
  20. Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
  21. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
  22. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
  23. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  24. Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
  25. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  26. Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
  27. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
  28. Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
  29. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
  30. Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
  31. Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).

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