방법 논문

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

DOI:

10.3791/527

⸱

2007년 12월 4일

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

이 논문에서

요약

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이 비디오에서는 실험자가 면역 질환 encephalomyelitis와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

초록

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이러한 실험 면역 encephalomyelitis (EAE, 1), 또는 급성 회백수염, 라임 neuroborreliosis 또는 neurosyphilis로 CNS의 감염에 대한 면역 반응으로 중추 신경계 (CNS)에 감독 면역 질환을 공부하든, 그것은 자주 CNS - 침투 면역 세포를 분리하는 데 필요한.

이 비디오 프로토콜에서 우리는 EAE와 암흑의 CNS에서 mononuclear 세포 (MNCs) 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 첫 단계는 피를 CNS 물을 대는 혈관에 남아하지 않도록 생리 식염수와 설치류의 심장 재관류가 필요합니다. 모든 혈액 오염 인공적으로 명백한 CNS - 침투 MNCs의 수를 증가하고 침투해 면역의 명백한 구성을 변경할 수도 있습니다. 그렇다면 우리는 단일 세포 현탁액을 준비하는 후속 dilaceration에 대한 쥐의 두뇌 및 척수를 제거하는 방법을 보여줍니다. 이 정지는 MNCs을 분리하기 위해 두 계층 Percoll 기울기에 구분합니다. 세척 후,이 세포가 모든 필요한 절차를 거쳐 준비가 된 것입니다.

이 프로 시저를 사용하여 격리 Mononuclear 세포가 가능한하고 전기 생리학, 유동세포계측법 (외과), 또는 생화학 사용할 수 있습니다. 기술은 멸균 조건하에 수행되는 경우 (조직 문화 후드에 살균 장비를 사용) 세포도 조직 문화 매체 재배하실 수 있습니다. 주어진 세포 인구는 더욱 자기 분리 절차 또는 외과 중 하나를 사용하여 정화하실 수 있습니다.

프로토콜

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  1. 깊이 쥐가 마취. 70 % 에탄올로 스프레이하고 혈관에서 세포를 (좌심실을 통해 오른쪽 심방과 perfuse를 잘라)를 제거하는 10 분 PBS와 심장 재관류 해.
  2. 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 50 ML 튜브의 뇌 및 척수 및 장소를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 10 ML을 포함 10cm 배양 접시에 놓인 70mm 셀 스트레이너의 뇌 및 척수를 자르고. 살균 한 ML 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 셀 스트레이너를 통해 기관의 각 조각을 누르십시오. 얼음에 50 ML 튜브에 단일 세포 현탁액를 수집합니다. PBS로 세포 스트레이너를 씻고 솔루션은 분명 때까지 튜브에 추가할 수 있습니다.
  3. G. 390에 80-10 분 원심 분리기
  4. PBS + 70 % Percoll 10 ML에 20 ML PBS + 30 % Percoll과 오버레이에있는 세포를 Resuspend.
  5. 상온 20 분 390g에 원심 분리기.
  6. 튜브의 상단에있는 지방을 제거합니다. 인터페이스에서 세포를 수집하고 PBS로 두 번 씻는다. 백작.

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토론

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이 절차는, 살아있는 동물과 관련된 모든 절차로, 귀하의 기관의 동물 사용 및 관리위원회의 승인을 받아야합니다. 우리는 전에와 절차를 수행하는 동안 동물에 주어집니다 마취의 충분한 수준을 보장하기 위해 최초의 심장병 perfusions을 수행할 때 수의사 또는 동물 기술자가 존재하는 것이, 그리고 동물들이 불필요 통증이나 고통을 받아야하지 않는 것이 좋습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBS, 1x, 멸균시약GIBCO, by Life Technologies14190-250
세포 스트레이너, 70 um도구Fisher Scientific08-771-2
Percoll시약Sigma-AldrichP1644

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.

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