모리스 물 미로 테스트 : 마우스 스트레인 및 테스트 환경을위한 최적화

Summary

이 원고는 일반적으로 사용되는 알츠하이머병의 마우스 모델과 함께 사용하도록 맞춤화된 Morris water maze(MWM) 프로토콜을 설명합니다. MWM은 형질전환 마우스 모델에 널리 사용됩니다. 마우스 모델의 배경 변형률에 민감한 절차의 구현은 그룹 차이를 감지하는 데 필수적입니다.

Abstract

MWM(Morris water maze)은 알츠하이머병과 같은 신경인지 장애를 포함한 질병의 형질전환 마우스 모델에서 해마 의존성 공간 학습 및 기억을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 작업입니다. 그러나 사용된 마우스 모델의 배경 변형은 관찰된 행동 표현형에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 일부 변형은 다른 균주에 비해 우수한 학습 능력을 나타냅니다. 전이유전자 음성 마우스와 전이유전자 양성 마우스 간의 차이를 감지할 수 있도록 하려면 배경 변형에 민감한 훈련 절차를 식별하는 것이 필수적입니다. MWM 프로토콜을 마우스 모델의 배경 변형에 맞게 조정하지 않으면 훈련이 부족하거나 과도하게 진행될 수 있으며, 이로 인해 프로브 시험에서 그룹 차이가 가려질 수 있습니다. 여기에서는 F1 FVB/N x 129S6 배경과 함께 사용하도록 조정된 MWM 프로토콜에 대해 설명합니다. 이것은 알츠하이머병과 관련된 기억력 결핍에 대한 돌연변이 P301L 타우(rTg(TauP301L)4510 마우스)의 연령 의존적 효과를 연구하기 위해 자주 사용되는 배경 균주입니다. 또한 사용된 특정 테스트 환경에 따라 다시 최적화하기 위한 전략도 설명되어 있습니다.

Introduction

형질 전환 마우스 모델은 알츠하이머 병 (AD)의 병태 생리학뿐만 아니라, 치료 적 개입의 가능성을 평가하는 수단이되어왔다. 이러한 모리스 물 미로 (MWM)인지 적 작업은 일반적으로 기억력 결핍의 분자 상관 관계를 파악하고 전임상 약물의 효능을 평가하기 위해 이러한 모델과 함께 사용된다. 이는인지 작업의 동적 범위는 치료 효과 미묘한 검출 충분히 넓은 것이 그러나 중요하다. 광고의 마우스 모델,인지 적자는 일반적으로 나이에 따라 달라집니다, 그리고 마우스는 성능이 점진적 감소를 표시 (예를 들면, ^1). 민감한 태스크인지를 사용하여 동물 노화와 관련된 비용을 줄일 이전 동물의 생명에 미묘한 차이를 검출 할 수있다. 예를 들면, 해마 의존적 반스 훈련 실험의 수를 줄이는 것이 15-5 미로 D 결과, 작업의 어려움을 증가보다 이른 나이에 3xTg 모델에서 적자의 금 속 탐은 이전에 ^{2를보고했다.} 적자 이전 검출뿐만 아니라 이것은 또한인지 결핍의 기초 분자의 변화를 식별 할 수있는 가능성이 높아, 상당한 시간과 비용 절감을 제공한다.

인지 작업의 감도에 영향을 미치는 하나의 요인은 마우스 모델의 유전 배경 균주이다. 예를 들어, BALB / c 마우스는 C57BL / 6 ^(3)과 같은 다른 균주에 비해 과제 학습 및 기억에 우수한 성능을 나타낸다. F1 FVB / N X 129S6 배경은 AD의 가장 널리 사용되는 모델 Tg2576 및 RTG (TauP301L) 4510 모델이 사용된다. 이 균주는 B6 / SJL 마우스 ^(4)를 포함하여 다른 균주에 MWM 상대적으로 우수한 학습 능력을 나타낸다. 이 때문에 우수한 학습 능력, 광범위한 훈련 후 단일 프로브의 사용은 오버 - 트레이닝으로 인한 그룹 차이를 마스크 할 수있다. 또한, sensitivit프로브 시험의 Y는 연령에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 이전에 이전 프로브 시험은 제한 숨겨진 플랫폼 훈련 후,보다 젊은 형질 전환 유전자 음성 한배의 새끼 컨트롤에 비해 젊은 Tg2576의 차이에 더 민감 더 광범위한 훈련 ⁽⁵⁾ 다음에 삽입 프로브 시험 있음을 보여 주었다. 이전 프로브 시험 ^5보다 대조적으로, 광범위한 교육을 다음과 같은 검사 시험은 이전 한배 새끼에 비해 Tg2576 마우스 이전 (20 ~ 25 월)에 더 민감하다. 길이 시험이 수행되고, 특정 프로브 시험의 감도 연령 의존적 인 경우 특히 훈련 ​​내내 프로브 시험을 산재하여 민감한 재판이 식별 될 가능성이 증가된다. 1 F1 FVB / N (X)의 우수한 성능을 보여준다 더 광범위한 훈련 프로토콜에서 훈련 B6 / SJL 배경의 마우스에 비해이 변형에 최적화 된 프로토콜에 따라 129S6 마우스.

MWM은일반적으로 시간과 실험실 ⁽⁶⁾ 모두에서 재현 할 수있는 신뢰할 수있는 수단을 제공하기 위해 생각했다. 예를 들어, 원래 우리의 미네소타 실험실 ^1,7에서 사용되는 기본 프로토콜이 성공적으로 웨스트 버지니아 대학 ^8에 약간의 수정으로 구현되었습니다. 마찬가지로, 손상 동등한 수준 무균 또는 통상 조건 하에서 ^구 수납 경우 한배 새끼를 제어하기 위해 4510 생쥐 상대 RTG (TauP301L)에서 관찰되었다. 그러나, 테스트 환경 MWM 태스크의 민감도에 영향을 미칠 수있다. 같은 실내 조명, 환기구, 온도 구배 및 소음 등의 모든 요소가 궁극적으로 성능에 영향을 미칠 수있는 환경 단서 ^4에 기여한다. 우리 미네소타 실험실 동물 사육장은 신축 이동 하였을 때, 최대 야생형 성능의 38 % 감소는 실질적으로 작업 및 트랜스 - 관련 결핍을 탐지 할 수있는 능력의 동적 범위를 감소가 관찰되었다. PE의 변화rformance 동등한 크기 및 구성으로 검사실을 설계하고, 동일한인가 시각적 큐를 사용에도 불구하고 발생 하였다. 본래의 프로토콜 A "재 최적화가"새로운 테스트 환경에서 MWM 태스크의 동적 범위를 증가시키기 위해 요구되었다.

여기에 F1 FVB / N와 함께 사용하기위한 맞춤형 원래 프로토콜은 129S6 배경 ⁵ 설명 X. 일부 연구는 응력을 제시하기 때문에 성능 ^(11)이 스트레스 유도 결손 완화 불량한 MWM 성능 ⁽¹⁰⁾ 및 사전 처리와 연결되어, 사전 처리 프로토콜은 풀의 도입 및 제거 전에 MWM 테스트 행에 쥐를 순응하도록 설계되었다 . 사전 처리 후, 마우스 제기 플랫폼 플래그가 표시되는 볼 플랫폼 교육을 받다. 눈에 보이는 플랫폼 훈련은 감각 이상과 관련된 성능 문제로 쥐를 식별하는 데 사용됩니다. 제자에 설명 된 배제 기준을 사용하여ocol 섹션, 성능 무능한 마우스 숨겨진 플랫폼 교육 및 프로브 시험 이후의 시험에서 제거됩니다. 감각 성능 데이터에서 고려되기 때문에 숨겨진 플랫폼 교육 및 프로브 시험에서 장애인지 적자로 해석됩니다. 가시 플랫폼 훈련 종료 후, 마우스는 플랫폼을 물에 잠긴 외부 큐에 대해 동일한 위치에 유지된다 숨겨진 플랫폼 트레이닝을 시작. 플랫폼 (프로브 시험)을 제거하는 시험이 추가 교육의 영향을 평가하기 위해 숨겨진 플랫폼 교육 전반에 걸쳐 산재되어있다. 프로브 실험은 하루의 시작 부분에서 발생하기 때문에 추가적인 숨겨진 플랫폼 트레이닝 전에, 프로브 실험은 20 시간 지연에 따라 플랫폼의 위치를 기억하는 동물의 능력을 측정하고, 기준 메모리 ^(12)의 측정 값을 고려 하였다. 마지막으로, 방법은이 프로토콜은 원래 다시 최적화 될 때 테스트 환경 변화중단 제어 성능이 설명되어 있습니다.

Protocol

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 기준에 따라 수행과 웨스트 버지니아 대학의 IACUC에 의해 승인되었다.

1. 사전 처리

1. 풀 설정
   1. 이 편안한 높이로 상승되도록 사전 처리 풀 소품.
   2. 약 1cm의 레벨로 사전 - 처리 풀에 물 2 L (21 ℃에서)를 놓는다.
      참고 : 색상을 추가하지 마십시오.
2. 순서
   1. 테스트 룸에 동식물 사육장에서 쥐를 가져와.
   2. 주제 식별 확인 (대상 번호, 꼬리 문신, 귀 클립, 등.).
   3. 영구 마커 마크 마우스의 꼬리는 테스트 할 남아있는 것과 테스트를 미리 처리받은 케이지 내에서 마우스를 구별한다. 같은 색으로 한 장에 모든 쥐를 표시합니다.
   4. approxima위한 전사 비이커에 마우스를 놓고tely 5 초. 그런 다음, 부드럽게 사전 처리 풀에 비커에서 마우스를 붓는다.
   5. 타이머를 사용하여, 마우스를 20 초 동안 풀에 남아 있도록.
   6. 20 초 후, 부드럽게 마우스의 앞에 (를 낚시를하지 않고) 특종을 배치합니다. 간단히 마우스가 특종을 탐구 할 수 있도록, 필요한 경우, 천천히 들어올 리면서 부드럽게 마우스의 특종을 밀어 국자에 얻을 수있는 마우스를 권장합니다. 국자와 마우스를 놀라게하지 않도록주의하십시오.
   7. 마우스 국자로되면, 유지 케이지로 다시 전송.
   8. 십일을 위해 하루에 한 번 케이지에서 각 마우스에 대해이 절차를 반복합니다. (각 동물 한 것과 같이) 일정한 간격으로, 그물을 사용하여 풀에서 배설물 boli과 침구를 선택합니다.
   9. (마우스의 케이지의 완료 후 예) 일정한 간격으로 물을 전송 비이커를 씻어.
   10. 이 단계가 완료되면, 물로 여러 번 전송 비이커 린스 물을 덤프풀은, 물과 풀을 약 2 회 헹군다.

2. 눈에 보이는 플랫폼 교육

1. 설치 마우스 성능 추적 소프트웨어 예 : 뷰어 (재료의 표 참조).
   1. "필터와 객체"탭 - '설정'에서 미로의 크기에 맞게 비디오를 보정합니다.
   2. 소프트웨어가 배경에서 마우스를 구별 할 수 있도록 필터를 설정합니다.
      1. 추적 소프트웨어는 동물을 식별하도록 "배경 화면 필터"영역 아래 "민감도"를 조정한다.
      2. 추적 소프트웨어가 동물을 식별하면 "동의 함"옵션을 클릭합니다. 미로 영역 이외의 영역을 블랙 아웃 할 수있는 "편집"옵션을 선택합니다.
      3. 해당 "동물 필터"와 "분을 선택합니다. 동물의 크기 ".
2. 실행 시트를 만들기
   1. 각 마우스를 나열하는 실행 시트, 각각의 잠재적 위치 및 비정상적인 동작에 대한 정보를 포함하는 메모 공간을 만듭니다.
   2. 생쥐의 각 그룹에 대해 동일한 표시 플랫폼 테스트 위치를 미리 결정. 따라서, 제 재판, 플랫폼은 마우스가 벽에 가까운 오른쪽에, 미로에 배치되는 위치에 반대 측에 배치되는 것을 사전에 결정한다. 제 재판, 플랫폼은 각각의 마우스에 대한 방벽을 따라 다른 위치에 배치 될 것임을 미리 결정하고 이는 6 실험마다 계속 될 것으로.
3. 객실을 설정
   1. 방 놀아 커튼 있도록 모든 공간 단서가 가려한다.
4. 욕조를 설정합니다.
   1. 는 "구성"의 구성 설정와 일치하는 미로를 확인하여 추적 소프트웨어의 구성과 일치하도록 욕조를 배치 - "존 정의"탭을 선택합니다. 참고 : 시간elps는 욕조 욕조는 한번의 충전 이전되지 않는 물로 충전하기 전에 적절한 위치에 있는지 확인합니다.
   2. 수돗물 욕조를 입력하고 온도계를 사용하여 물 온도가 약 21 ℃를 확인합니다. 세 쥐 ^(8)을 사용하는 경우 차가운 물이 특히 성능에 영향을 미칠 수있는 물이, 테스트를 통해이 온도 1도에서 남아 있는지 확인합니다.
      참고 : 색상을 추가하지 마십시오.
   3. 소정의 위치를​​ 사용하여, 13cm의 높이에 도달하여 터브의 제 1 위치에서 굵은 "S"그것에 양각 모양의 문자와 4.5 cm가 X 4.5 cm이다 장착 플래그가 플랫폼을 배치되도록 그것 대략 1 인치 수면 위에.
5. 순서
   1. 비커에 정확한 색상의 영구 마커를 사용하여 꼬리, 그리고 장소를 표시, 케이지에서 첫 번째 마우스를 가지고 주제 ID를 확인합니다.
   2. 부드럽게 MOUS를 배치터브 내로 E는, 타이머를 시작하고, 추적 소프트웨어는 동물 추적되도록. 2 분에 마우스까지 플랫폼을 찾을 수 있습니다. 마우스가 플랫폼을 찾으면, 플랫폼에서 마우스 20 초를 할 수 있습니다.
   3. 동물이 플랫폼을 찾아 이동 또는 낙하로 진행하는 경우, 마우스를 특종과 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 마우스를 이동하거나 플랫폼을 떨어져 계속되면, 플랫폼에서 마우스를 잡고, 그래서 마우스가 플랫폼에 남아있는 욕조에서 탈출 리드 것을 배운다.
      참고 : 마우스가 20 초에 결합 된 시간 동안 플랫폼에 남아 있어야한다; 마우스가 5 초 후에 꺼 점프한다면, 플랫폼에 남아있는 시간은 15 초이며, 20 초에 다시 설정하지 않습니다.
   4. 동물은 2 분주기에서 플랫폼을 찾는 데 실패하면, 마우스를 국자 20 초 동안 플랫폼에 배치.
   5. 플랫폼에서 20 초 후, 사전 처리 훈련 수행으로 플랫폼에서 마우스를 제거하고 일에 마우스를 올려전자 가열 케이지는 종이 타월로 늘어서 30 초 동안 가열 패드와 가열 램프에 의해 ~ 31 ° C를 따뜻하게. 특정 연령에서 마우스 또는 쥐의 특정 균주를 보장하기 위해 직장 온도계로 체온의주기적인 평가를 수행 물에 노출에 의해 유도 저체온증에 차동 민감하지 않습니다.
   6. 가열 램프 지주 케이지 2 분 후, 시험 사이에서 복구만을 가열 패드, 그러나 가열 램프로 유지 케이지에 마우스를 옮긴다. 결국, 테스트 기간 동안 동일한 유지 케이지에 하나의 홈 케이지에서 마우스를 모두 넣습니다.
   7. 각 마우스는 시험을 완료 한 후 후각 신호를 방해, 그물 파편의 미로를 청소합니다.
6. 그룹의 각 마우스에 대해 이러한 단계를 반복합니다. 각 마우스는 첫 시도를 완료 한 후, 제 2 소정 위치로 이동 플랫폼.
   주 : 플랫폼 단일 시험 동안 각 마우스에 대해 동일한 위치에 남아되고계속되는 시련의 다른 소정의 위치로 이동. 이것은, 2), 따라서 그대로 시각적 인 능력을 보여, 눈에 보이는 플랫폼에 직접 수영에서 탈출 할 수있는 플랫폼이 배우고 3)에는 모터 적자가 없습니다) 그 쥐 1을 보장하기위한 것입니다.
7. 테스트의 처음 3 일 동안 6 시험에 대해 다음 절차를 수행합니다. 따라서, 각각의 시험 사이에 약 10 분 (도 2)와, 테스트 일 1, 2, 3에 표시 훈련을 수행한다.
8. 가시 플랫폼 훈련 동안, 플랫폼에 도달하는 지연 시간을 측정 동물의 경로 길이를 추적하기 위해 동물 추적 소프트웨어를 사용하고, 수영 속도. 엑셀 스프레드 시트에 "실험 목록"직접 수출에서 "물 미로"탭에서 이러한 측정을 얻습니다.
   주 : 손 타이머의 사용은 또한 추적 소프트웨어의 정확도를 보장하는 것이 유익 할 수있다.

3. 모리스 물 미로 숨겨진 플랫폼 교육

1. 에스객실 업 등
   1. 실험실에서 공간 단서를 모호하게 방에 커튼을 끊습니다.
   2. 커튼에 전략적으로 신호를 놓습니다. 단서가 큰 것을 확인하고 더 나은 가시성 대조 색상을 (예 : 흑백)을 포함한다. 그들은 욕조 내부에서 마우스로 볼 수 있습니다 거리와 높이에 꽉 큐. 참고 : 큐는 정적 및 테스트 과정에서 이동하지 않습니다.
2. 마우스 성능 추적 소프트웨어 설치
   1. "필터와 객체"탭 - '설정'에서 미로의 크기에 맞게 비디오를 보정합니다.
   2. 소프트웨어가 배경에서 쥐를 구별 할 수 있도록 필터를 설정합니다.
      1. 눈에 보이는 플랫폼 테스트에 설명 된대로 모리스 물 미로 숨겨진 플랫폼 훈련에 대한 필터를 설정 (2.1.2.1-2.1.2.3 단계)과 동일한 방법을 사용합니다.
   3. 미로 내부에 네 개의 동일한 사분면 만들기
      1. 클릭"존 정의"탭에서 "타원"옵션을 먼저하고 화면의 미로와 일치하는 원을 만듭니다. 참고 :이 탭에서 설정 한 실제 미로 표시, 그래서 실제 미로 설정과 컴퓨터 설정에 맞게 옵션을 할 수있다.
      2. "사각형"옵션을 클릭하고 네 개의 동일한 사각형을 만들 수 있습니다. 새로 생성 된 원 안에 네 개의 동일한 사분면을 생성 화면에서 다음 사각형을 배치합니다.
   4. 미로의 플랫폼을 만듭니다.
      1. "타원"옵션을 선택하고 원에게 사용되는 플랫폼의 크기를 만들 수 있습니다. 주 : 미로의 플랫폼을 배치하면 사전에 타원에게 플랫폼의 정확한 크기를 만드는 데 도움이 될 수 있습니다.
      2. 대상 사분면의 중심에 새로 만든 플랫폼의 위치를​​ 놓습니다. (그것은 나머지에서 올바른 플랫폼을 구분하기 위해이 객체 "대상"을 이름을 권장). 중요한 단계 : 상자에서 바로 벨"그리드"아야, 대상 플랫폼을위한 "트리거"에서 "중지"옵션을 선택합니다. 이 마우스가 플랫폼에 도달하면 프로그램이 중지 될 것입니다.
      3. 다른 세 동일한 플랫폼 영역을 생성하고 다른 사분면의 정확한 위치에 배치합니다. 선택하지 마십시오 "트리거"옵션에서 "정지".
3. 실행 시트 만들기
   1. 각 마우스, 각 시험, 플랫폼에 도달하는 시간을 쓸 수있는 공간을 나열하는 실행 시트 및 비정상적인 행동 (표 1) 참고로 공간을 만듭니다.
   2. 의사 랜덤 방식으로 각 마우스의 릴리스 포인트를 미리 결정한다. 플랫폼에 처음부터 의사 - 랜덤 플랫폼까지의 거리가 4 위치 각각 똑같이 사용되고, 매일 동일하도록 선택하고, 각도를 사용 (예., 왼쪽 또는 오른쪽) 내에서 일 사이에 균형을 이룬다.
      참고 : 플랫폼의 위치를​​ 실행에시트는 원래 위치로부터 이동하지 않는 플랫폼의 위치를​​ 보장한다. 플랫폼 추적 소프트웨어에서 만들어진 네 영역 중 하나의 중심에 있는지 확인.
      참고 : 세로 테스트가 다양한 연령대에서 수행되는 경우, 각각의 나이에 새 위치로 플랫폼을 이동합니다.
4. 미로 설정
   1. "존 정의"탭 - 물 미로 미로하고 "구성"의 구성 설정 사이의 일치가되도록 카메라를 조정합니다.
   2. 미로 (N, S, E, W)의 네 보이지 않는 사분면 레이블. 쥐를 보장하기 위해 추적 소프트웨어의 구성이 일치하는 정확한 시작 지점에서 방출되고 있음을 확인합니다.
      중요한 단계 : 장소 미로의 외부 미로 내에서 큐가 아닌 공간, 비 해마 의존하는 작업을 구성 주어진 수영 동물의보기 중이 라벨.
   3. 탭 식 수용으로 미로를 채우R (대략 21 ° C) 플랫폼은 수면 아래 약 5mm가되도록.
   4. 소정의 위치에 플랫폼을 놓습니다.
      참고 : 플랫폼의 위치는 모든 일 시험을 통해 테스트중인 모든 마우스에 대해 동일하게 유지됩니다.
   5. 물이 불투명하기 위해 비 독성 흰색 템페라 페인트를 사용합니다. 플랫폼의 상단이 수영하는 동안 동물의 눈높이에서 눈에 보이지 않는 것을 확인하기 위해이 작업을 수행합니다.
5. 순서
   1. 케이지에서 마우스를 가지고 정확한 색상의 영구 마커를 사용하여 꼬리를 표시하고 비커에 넣습니다.
   2. 이 벽을 마주 진입하도록 부드럽게, 미로에 마우스를 붓는다. 주 : 각 마우스 고유 재판 동일 개시 위치에 배치 될 것이다.
   3. 마우스의 초기 릴리스에서, 타이머를 시작하고 테스터가되지 쉽게 볼 마우스입니다 지역에 서있다. 그 동물 추적 소프트웨어가 제대로 동물을 추적해야합니다.
   4. 동물이 플랫폼에 도달하면, 그것은 15 초 동안 플랫폼에 남아 있도록.
      참고 :이 방 내에서의 공간 위치로 방향을 동물을 수 있습니다.
   5. 플랫폼에서 15 초 후, 미로에서 동물을 제거하고 가열 케이지에 마우스를 반환합니다.
   6. 마우스가 플랫폼을 발견하고 뛰어 15 초 전에 떨어져로 진행하는 경우, 마우스를 퍼 마우스가 탈출과 플랫폼을 연결하는 학습 있도록 15 초 나머지 플랫폼에 다시 배치합니다.
   7. 마우스가 60 초 이내에 플랫폼을 찾지 않는 경우, 부드럽게 마우스를 특종과 플랫폼에 놓습니다. 그 다음, 15 초 동안 플랫폼에 남아있는 국자 동물을 제거하고 가열 케이지로 다시 가져올 수 있습니다.
   8. 후각 신호를 방해 그물 파편의 미로를 청소합니다.
   9. 그룹의 나머지 마우스에 대해이 절차를 반복합니다. 따라서, 테스트 일 4 ~ 9을 위해, 숨겨진 플랫폼 열차의 네 가지 시험을 실시각 시험 사이에 약 20 분으로 하루 보내고.
   10. 각 시험의 시작 위치 pseduorandomly을 변경합니다. 이에 따라, 시험 기간 동안 1, 그 후, 동일 개시 위치에서 마우스를 모두 해제 계속되는 실험에 다른 초기 위치로부터 절차를 반복한다. 매일, 비 공간 비 해마 의존적 운동 근육 전략을 개발하지 않는 동물을 위해 릴리스 포인트를 변화. 생쥐가 첫날에 N, S, E, W 및 포인트로부터 방출되는 경우, 예를 들어, 다음과 같은 일이 순서로 해제하지 않는다.
   11. 숨겨진 플랫폼 훈련 동안, 플랫폼, 동물의 경로 길이 및 시간의 비율에 도달 또는 동물 미로 각 사분면에 보낸다 거리를 지연 시간을 측정하기 위해 동물 추적 소프트웨어를 사용한다. "실험 목록"에서 "물 미로"탭에서 이러한 측정을 얻고 Excel 스프레드 시트에 직접 내보낼 수 있습니다.
       주 : 손 타이머의 사용은 추적의 정확성을 보장소프트웨어.

4. 프로브 시험

1. 마우스 성능 추적 소프트웨어 설치
   1. 한 가지 예외 (3.2.1-3.2.4.3 단계) 모리스 물 미로 숨겨진 플랫폼 절차와 동일한 절차를 사용합니다. 중요한 단계 : 프로브 시험은 "트리거"에 대한 "중지"옵션을 보장 프로브 시험 중에 전원이 꺼집니다. 이것은 마우스가 플랫폼 영역을 교차 할 때 중지하는 프로그램을 방지한다.
2. 실행 시트 만들기
   1. 각 마우스, 각 시험 및 비정상적인 행동을주의 할 공간을 나열하는 실행 시트를 만듭니다. 그들은 플랫폼 반대 양측 교대하도록 프로브 시험 중에 릴리스 포인트를 미리 결정한다. 따라서, 사전 - 결정 생쥐 플랫폼에 인접하는 양측으로부터 해제되지 않도록 릴리스 포인트.
3. 순서
   1. excep와 함께, 숨겨진 플랫폼 훈련과 유사한 프로브 시험을 실시어떤 플랫폼이 미로에없는 기.
   2. 소정 릴리스 포인트에서 마우스를 놓습니다. 프로브 재판 과정에서 플랫폼을 제거하고 마우스 미로에서 수영하는 60 초 있습니다.
   3. 테스트하는 동안, 4 프로브 시험을 실시하고 있습니다. 프로브 시험의 마우스의 릴리스 포인트를 변경합니다. 따라서, 이전 프로브 시험과는 전류 프로브 재판의 릴리스 포인트를 변경합니다.
   4. 프로브 시험 동안, 동물의 경로 길이를 추적하기 위해 동물 추적 소프트웨어를 사용하여, 동물 미로의 각 사분면에서 소비 시간의 비율, 그리고 동물들이 이전를 플랫폼 영역 위에 수영 횟수. Excel 스프레드 시트에있는 "데이터 분석"탭과 "실험 목록"에서 "물 미로"탭, 직접 수출에서 이러한 측정을 얻습니다.
      주 : 손 타이머의 사용은 또한 추적 소프트웨어의 정확도를 보장하는 것이 유익 할 수있다.
   5. 이전에 프로브 시험을 실시일 6, 7, 8, 10 (그림 2)에 숨겨진 플랫폼 훈련. 이 프로브 시험 후, 매일 훈련 숨겨진 플랫폼의 4 임상 시험을 실시한다. 따라서, 10 일에 프로브 재판 후 추가 숨겨진 플랫폼 훈련을 수행하지 않는, 반대로 3 절에 설명 된대로 먼저, 즉시 동일한 절차를 사용하여 모든 마우스에 대한 숨겨진 플랫폼 훈련 다음에 프로브를 수행합니다.

5. 분석

1. 눈에 보이는 플랫폼 교육
   1. ANOVAs 개별적으로 (a) 경로 길이에 대해, (b) 대기 시간이 플랫폼을 찾기 위해, 그리고 (c) 사이에 피사체 변수 일 또는 트레이닝 블록들만큼 (예를 들면 치료로, 또는 다른 변수) 유전자와, 수영 속도 반복 측정을 실시 피험자 내 변수입니다. 참고 : 더 복잡한 설계를 들어, 통계와 상담 유용 할 수 있습니다. 그룹에 대한 자세한 내용은 ^{8, 13 참조} 제대로 알츠하이머 병의 일반적으로 사용되는 모델이 작업에 전력을 공급하기에 충분한 크기7; 병.
   2. 성능 무능력
      1. 시험의 절차 적 요소를 획득, 숨겨진 플랫폼과 프로브 성능의 후속 통계 분석에서 이러한 쥐를 제거하지 않는 시각적 또는 모터 무능력을 보여 마우스, 또는 동물을 포함하여, 성능 무능한 마우스를 식별합니다.
         1. 평균 대기 시간을 계산하고 각 마우스 볼 플랫폼 훈련의 마지막 날을 위해 속도를 수영. 이 모터 나 시각 장애를 나타내는 수있는 바와 같이, 그룹 위의 2 표준 편차의 의미 수단 쥐를 제거합니다.
         2. 확인하고 동양에 실패 쥐를 제거하거나 탈출 특종을 따라, 또는 코르크 스크류 수영 또는 부동 같은 비정상적인 행동을 보이는 생쥐,.
2. 모리스 물 미로 숨겨진 플랫폼 교육
   1. (a) 경로 길이에서 반복 측정을 실시 ANOVAs, (b) 대기 시간이 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해, (c)는 속도, (d) %의 시간 또는 퍼센트 수영피험자 내 변수로 간 주제 변수 및 시험 등의 유전자와 사분면의 거리.
3. 프로브 시험
   1. 수영 속도
      1. 피험자 내 변수로 간 주제 변수와 실험으로 유전자와 프로브 시험을 통해 수영 속도에 반복 측정의 ANOVAs을 실시한다.
   2. 플랫폼 교차 색인
      1. 다른 세 사분면에 동등한 위치의 평균 횡단 - 마우스 대상 위치를 가로 지르는 횟수 PCI = 번호 : 각각의 마우스에 대해 프로브 시험 구성을 사용하여, 플랫폼 횡단 지수 (PCI)는 다음 식을 이용하여 계산된다.
         주 : 더 훈련 플랫폼 위치 위에 횡단 또는 thigmotaxic 수영 비 공간 전략에 의해 나타낸 바와 같이, 모두 4 개소에 걸쳐 대략 동일한 교차점으로 나타낸 바와 같이 이것은, 마우스 공간 탐색 방법을 사용하고 있는지 여부를 결정하기 위해 수행된다.
      2. 행동을 반복피험자 내 변수로 사이에 대상 변수와 시험과 같은 유전자를 가진 PCI에 측정 ANOVAs.
   3. 백분율 시간이나 사분면 %의 거리
      1. %의 시간을 계산하거나 각 마우스 미로의 네 사분면에서 소비 거리. 피험자 내 변수로 간 주제 변수와 실험으로 유전자로, 시간의 퍼센트, 또는 거리에서 반복 측정 ANOVAS을 실시한다. 공간 탐색 방법이 사용되는지 여부를 결정하기 위해 시간 퍼센트를 사용한다; 대상 사분면에 약 25 %의 시간의 결과는 쥐가 기회 레벨에서 수행하고 공간 검색 전략을 사용하지 않는 나타냅니다.
   4. O / N은 ​​잊고
      1. 전날의 최종 재판 플랫폼을 찾기 위해 대기 시간에 프로브 재판 플랫폼 영역 횡단의 대기 시간을 비교한다. 참고 : 프로브 재판의 플랫폼 교차의 대기 시간 플랫폼,을 찾을 수있는 대기 시간보다 훨씬 긴 경우전날에 숨겨진 플랫폼의 마지막 재판 중에 M, 플랫폼 위치의 다음 O / N의 망각이 발생한다.
4. 사후 분석
   1. 각각의 재판에서 형질 전환 유전자의 사후 비교에 중요한 RMANOVAs을 따르십시오.

새 테스트 환경에 대한 재 최적화 6. 예

1. 사전 처리. 주택 방에서 사전 처리를 실시한다. 전체 세션에 대한 전송 카트에 뚜껑없이 케이지를 놓습니다.
   참고 : 사전 처리 절차의 수정을위한 목적이 더 점진적으로 핸들러 조작 및 노출 운송 장치에 대한 소개 (비이커를 국자)과 시간 마우스는 자신의 새장의 microisolator 뚜껑없이 외부의 홈 케이지에 증가하는 오픈 필드와 밝은 조명 조건.
   1. 1 일 및 2
      1. 마우스 케이지에있는 손에 적응 할 수 있도록 허용, 부드러운 터치하여 다음문신 검사 및 꼬리의 마킹 해제되는 하였다. 사전 처리의 2 일에 시작, 뚜껑 ⁹ 제거 된 동안 둥지 건물과 쉼터에 대한 추가 자료를 제공하기 위해 새장에 추가 둥지 재료를 놓습니다.
   2. 3 일 및 4
      1. , 전송 비커를 놓고 특 종, 사전 처리 상자에 보이는 플랫폼의 국기와 마우스는 시험 당 2 분에서 2 시험에 대해 탐구 할 수 있습니다.
      2. 사전 처리 과정이 프로토콜에 물을 사용하지 마십시오. 오히려, 상자 바닥을 커버하기에 충분한 깨끗한 침구를 포함하고 남녀가 테스트중인 경우 여성과 남성 오염 쓰레기 소량의 냄새가되어 있는지 확인합니다. 매일 침구를 변경합니다.
   3. 5 일
      1. 20 초마다 가볍게 오염 된 쓰레기 3 시험에 대한 눈에 보이는 플랫폼 플래그를 포함하는 사전 처리 상자에 넣어 마우스. 및 상자에서 마우스를 수송하는 비커와 국자를 사용합니다.
2. 눈에 보이는 플랫폼 교육
   1. (정기적으로 미네소타 테스트 환경에 사용) 27 ° C에서 설정 수온.
   2. 큐 플랫폼을 획득시 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
   3. 60 초까지 마우스는 눈에 보이는 플랫폼을 획득 할 수 있습니다.
   4. 5 일간 하루 3 시험으로 구성된 교육 과정을 실시한다.
3. 숨겨진 플랫폼 교육
   1. 시각적 단서를 수정합니다. 하나의 큰 커튼 핸들러를 모호 어느 제거하거나 풀 주변 좁은 다른 커튼을 만드는 것을 제외 더 개방 공간을 갖도록. 방에 대한 추가 개체를 배치 (예를 들어, 노출 선반, 흰색 기호, 검은 색과 흰색 비치 볼, 큰 검은 퍼널, 노트북 및 검은 동물 인형 블랙 패브릭 포스터) 균형하지만 더 다양한 시각 cue- 결과, 이전에 사용보다 설정합니다.
   2. 눈에 보이는 플랫폼 traini의 숨겨진 플랫폼 교육 72 시간 다음 완료를 시작하기NG, 시험 사이에 약 30 분 간격으로.
   3. 팔일 2 시험으로 구성된 교육 과정을 실시한다.
4. 프로브 시험
   1. 프로브 시험 72 숨겨진 교육 시험 (8) 다음 시간, 12, 16.Include 시험 8-9 사이에 3 일 간격, 교육의 12 ~ 13을 수행합니다.
   2. 30 초 동안 프로브 지속 시간을 설정합니다.

Results

우리는 그림 3은 베타 - 아밀로이드 (Tg2576 마우스) 및 돌연변이 P301L 타우 공간 참조 메모리 (RTG (TauP301L) 4510 마우스) (예를 들면, ^1,5,7,8).의 효과를 연구하기 위해 모리스 물 미로를 사용했다 대표적인 결과는 모터 및 시각적 능력을 평가하기 위해 테스트 환경 A.을 이용하는, 학습 및 기억 ⁸ 성인 발병 P301L 타우 발현의 효과를 조사 연구에서보고 된 마우스는 각 트레이닝 블록으로 이루어져 볼 플랫폼 트레이닝 블록들간에 비교 하였다 3 시험. 눈에 보이는 플랫폼 훈련 경로 길이는 유전자가 긍정적 인 제안, 컨트롤 및 TauP301L 마우스 (그림 3A) 사이에 차이가 없었다 음의 마우스는 비교 수영을 나타내는 두 그룹은 시각적 (플래그) 플랫폼을 표시를 볼 수 있습니다. 어떠한 마우스 배제 기준에 따라 성능 무능으로 확인되지 않았다. 숨겨진 플랫폼 훈련 블록에서 다음...

Discussion

MWM 태스크 널리 공간 학습 및 기억을 평가하는 데 사용된다. 그러나,이 작업의 안정성은 많은 요인들에 의해 영향을 배경 균주 및 테스트 환경 모두의 최적화를 필요로 할 수있다. 도 4는 동일한 트레이닝 프로토콜에 나타낸 두 개의 다른 테스트 실 (동등한 크기 및 레이아웃)에 사용되는 시각적 적용된 상당히 상이한 프로브의 성능을 수득 하였다. 테스트 룸의 많은 기능이 공간 큐 ^4에 기여할 수 있기 때문에,이 두 개의 객실이 시험을 더 어렵게 만든 알 수없는 방식으로 유의 한 차이가 있다고 추측했다. 추가 미로 큐 수정에서는 효과적으로 시각적 큐의 수를 늘리는 것을 정했다. 또한, 커튼의 사용을 최소화하여, 존재할 수도있는 청각이나 후각 큐는 변경되고 있습니다. 두 개의 테스트 룸의 조명 수준은 그러나 새로운 동식물 사육장에서 홈 케이지 빛 레벨이 결과, 낮았다, 상당했다높은 조명 수준 차이에서 시험 방에 홈 케이지에서 갈 때. 그것은 BALB / c 마우스는 광 레벨을 제공하...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Viewer Tracking Software	Biobserve		이 특정 소프트웨어는 필수 사항이 아닙니다 - 다른 추적 시스템을 사용할 수 있습니다
사전 처리 풀			크기 대략 1 피트 너비 x 2 피트 길이 x 1.5 피트 깊이
플라스틱 비커			1 L
스쿱
작은 그물
스톱워치
무독성 백색 템페라 페인트			모든 색상의 페인트를 사용할 수 있지만 대부분의 추적 소프트웨어 프로그램에서는 페인트가 동물의 색상과 대비되어야 합니다.
눈에 보이는 플랫폼			색상은 미로의 색상과 대조되어야 함
커튼봉
욕조			일반적으로 흰색, 직경 약 4피트
숨겨진 플랫폼			물과 같은 색으로 칠함