미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.
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방법 논문
마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학
이 논문에서
요약
초록
CNS 상주 신경 면역 세포 인 미세 아교 세포는 별개의 기능 및 유전자 발현 프로파일과 액티브 상태로 전환하는, CNS 손상에 응답하여 자신의 형태와 크기를 변환. 건강, 상해 및 질병에 미세 아교 활성화의 역할은 불완전 인해 미세 환경의 변화에 따라 자신의 역동적이고 복잡한 규정을 이해 남아 있습니다. 이에 따라, 비 침습적으로 모니터에 중요하며, 본래 유기체 경시 소교 활성의 변화를 분석한다. 생체 내에서 활성화를 소교 연구 CNS 환경을 바꾸지 않고 동작 추적 소교 기술적 한계에 의해 지연되어왔다. 이는 장기간 변화 추적해야 만성 신경 퇴화, 특히 도전 중에있다. 망막, 비 침습적 라이브 영상 의무가 중추 기관, 시각화 및 만성 질환 중 미세 아교 세포 활성화의 역학을 특성화 할 수있는 강력한 시스템을 제공합니다.
생체 내 이미징, 세포 해상도와 미세 아교 세포를 시각화, 공 촛점 검안경 (cSLO) 및 CX3CR1 GFP / + 기자 마우스를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 대 세포 하위 집합의 세포 활성화와 밀도의 월별 변화 (망막 당 200-300 세포)를 정량화하는 방법을 설명합니다. 우리는 생체 화상의 자동 임계 값 기반 형태 계측 분석을 적용하여 망막 미세 아교 활성화의 실시간 추적을 위해 유용한 메트릭으로서 somal 영역의 사용을 확인한다. 우리는이 라이브 화상 취득을 사용 만성 녹내장의 마우스 모델에서 망막 신경 퇴행의 초기 단계에서 미세 아교 활성화 및 microgliosis의 동적 변화를 모니터링하기위한 전략을 분석한다. 이 방법은 망막과 시신경에 영향을 미치는 만성 중추 신경계 질환에서 신경 세포와 축삭 감소에 미세 아교 세포의 기여를 조사하는 데 유용합니다.
서론
미세 아교 세포는 독점적으로 초기 배아 발달 이후 성인기에 걸쳐 중추 신경계 (CNS)에있는 신경 면역 세포이다. 수용체의 복잡한 레퍼토리를 장착, 미세 아교 활동 및 지역 이질성이 인접 신경 아교 세포, 혈액 - 뇌 장벽 및 신경 염증성 세포 1,2 침투 자신의 양방향 상호 작용에 의해 조절된다. 그들이 항상성의 3,4의 섭동에 대한 자신의 영토를 샘플로 기저 소교 기능, 생리 유지 보수 및 수리에 기여한다. CNS의 부상 또는 질병 중, 미세 아교 세포는 반응 표현형에 자신의 전환을 트리거 신경 신호의 첫 번째 조치는 "미세 아교 세포 2,5-7 활성화 되나. 미세 아교 세포의 활성화는 세포 소마와 프로세스 크기 조정 및 6-9 리모델링에 연결되는 유전자 및 단백질 발현의 복잡한 사이클을 포함한다. 미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라, 셀 재분배클러스터링은, 셀의 수 (라 microgliosis)에서 로컬 전반적인 증가를 수반 할 수있다. 이것은 또는 혈액 유래 단핵구 3,4,7,10-14 모집없이 세포 증식과 자기 갱신에서 발생할 수 있습니다. 연령 의존적 만성 CNS 질병의 광범위한 범위에서 microgliosis 및 미세 아교 세포 활성화 평행 질병 진행을 유지 <....
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프로토콜
생체 내 이미징은 유타 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 무균 시설에서 수행된다.
참고 :이 영상 프로토콜은 망막 미세 아교 세포 및 침투 단핵구 / 대 식세포가 fractalkine 수용체 궤적 (CX3CR1)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 기자 마우스에 사용됩니다.
공 초점 주사 레이저 검안경으로 망막 GFP + 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 1. (cSLO)
- 절차를 수행하는 동안 35 ~ 37 ºC 사이의 마우스 온도를 안정화 세트 물 제어 난방 시스템 켜기, 2 개의 가열 패드를 연결합니다.
- 공 초점 주사 레이저 검안경 (cSLO) 시스템 (그림 2A)를 시작합니다. 각각의 마우스를 확인하고 2mm (환자 데이터 메뉴)의 각막 곡률을 설정합니다 정보를 입력, cSLO 프로그램을 엽니 다.
- IMA 준비카. 안전하게 소켓에 깨끗한 55º 넓은 필드 대물 렌즈에 맞게. 깨끗한 종이로 덮여 가열 패드를 확보하여 검안경 이미징 플랫폼을 준비합니다. 패드와 용지를 납작하게하고, 대물 렌즈의 이동을 차단하는 그것들을 유....
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결과
우리의 최근 생체 내에서 연구 시각화하고 늦게 신경 퇴행 59 만성 녹내장과의 관계의 초기 단계 반응 속도와 시신경 유두와 망막 미세 아교 변화의 패턴을 추적하는이 라이브 이미지 수집 및 분석 방법을 사용했다. 여기에서 우리는 개인의 젊은 이형 Cx3CR1-GFP의 DBA / 2J 망막의 중심 망막 (그림 5)의 넓은 지역에 걸쳐 미세 아교 세포를 시각화하는 cSLO 영상 획득 프로토콜을 보여줍니다. 높은 셀 해상도를 바탕으로, 우리는 라이브 영상 임계 값을 적용하고 형태 계측 학적 개별 GFP + 세포와 인 somata (그림 6)의 자동 분할을 허용하는 분석한다.
지역 microgliosis 및 / 또는 만성 녹내장이 모델에서 검출 신경 퇴행 이전 시대에서 미세 아교 세포 활성화의 개발을 모니터링하기 위해, 우리는 개인의 젊은 이형 CX에 총 미세 아교 세포의 세포 밀도의 월별.......
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토론
신경 퇴행성 질환 중 소교 세포의 수와 활성 형태의 실시간 모니터링은 세포 기능의 상세한 시각화를 허용 비 침습성 영상화 방법의 사용을 요구한다. 촬상 후, 소교 세포는 미세 아교 세포의 활성화를위한 판독 somal 같은 크기 및 / 또는 공정의 복잡성을 평가하기 위해 여러 단계의 임계치를 이용하여 형태 학적 분석을 위해 (분단) 고립되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 cSLO를 사용하여 라이브 영상 획득, 순차적 세포 및 소마 분할을 기반으로 미세 아교 활성화의 정량 분석하는 방법을 설명합니다. 우리는 망막의 만성 신경 퇴행성 질환의 맥락 2 개월 동안 망막 미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis의 역학을 평가하기 위해 이러한 전략을 적용 할 수 있습니다.
리포터 생쥐와 미세 아교 세포 / 말초 단핵 세포 유형
fractalkine 수용체의 조절하에 GFP를 발현 마우스의 사용 (CX3CR1)궤적 (.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
FluoRender 소프트웨어(R01GM09815)를 사용해 주신 유타 대학교 Scientific Computing and Imaging Institute에 감사드립니다. 이 연구는 녹내장 연구 재단(Glaucoma Research Foundation), 멜사 M. 및 프랭크 시어도어 바 재단(Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation), 미국 국립보건원(US National Institute of Health)의 보조금(R01EY020878 및 R01EY023621)과 (R01EY017182 및 R01EY017950)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DBA/2J 및 CX3CR1-GFP/+ 마우스 | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 및 00582 | 마우스는 유전적 부동을 방지하기 위해 3-4세대마다 새로운 브리더를 도입하여 사내에서 사육합니다. |
| 30&프랙12; G 바늘 및 1ml 투베르쿨린 슬립 팁 주사기 | BD, East Rutherford, NJ | 305106 및 309659 | |
| 2,2,2-트리브로모에탄올, tert-아밀 알코올 99% 및 인산염 완충액 식염수 정제 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 및 P4417 | Avertin 용액(pH 7.3, 멸균 여과)은 새로 만든 용액이거나 4°C에서 보관해야 합니다. C는 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다. |
| 열 요법 T / Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| 코튼 팁 애플리케이터 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1 % | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA 콘택트 렌즈, 1.70 기본 곡선, 3.2mm 총 직경, 0.40mm 두께의 중앙 | Cantor & Nissel Ltd., 노샘프턴셔, 영국 | G003709 | 렌즈는 멸균 PBS로 헹구고 폴리프로필렌 상자에 보관합니다. |
| HRA/Spectralis 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경 및 Eye Explorer 소프트웨어 | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | 버전 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | 버전 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | 버전 CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | 버전 2.13 | 프리웨어. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | 버전 4.30.01 |
참고문헌
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al.
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재인쇄 및 허가
