GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구 세포는 이식 후 호스트 피질에 통합 시냅스 개발하고, 분산. 이 세포는 쉽게 유전자 변형 GABA 성 전구 물질의 생체 내 연구에 이식하기 전에 형질 도입 할 수있다. 여기서 우리는 기존 Cre 호텔 라인과 Cre 호텔 의존 기자를 사용하여 특정 interneuron 하위 그룹을 대상으로 바이러스 성 라벨링 기술을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
배아 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE과 CGE)에서 파생 된 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 기능과 형태 학적으로 다양하다. 진출 별개 피질 interneuron 서브 그룹의 역할 이해를 만들어왔다 그러나, GABA 성 세포의 다른 유형의 발달 및 성숙에 기여할 수 손볼 여전히 많은 메커니즘이있다. 또한, 변경 GABA 성 신호는 자폐증, 정신 분열증과 간질의 표현형에 기여할 수있다. 특정 치운다 드라이버 라인은 고유 interneuron 서브 그룹의 기능을 소포 시작했다. 마우스 모델에서의 발전에도 불구하고, 효율적으로 생체 분자 접근법 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 연구하기가 어렵다. 이러한 세포의 세포 자율적 인 프로그램을 연구하는 데 중요한 기술은 호스트 피질에 MGE 세포의 이식이다. 이 이식 된 세포는 분화, 광범위하게 마이그레이션,차 기능적으로 통합 할 수 있습니다. 또한, MGE 세포를 효율적으로 접근 분자의 다수를 허용 이식 직전 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 여기서 사용할 치운다 드라이버 라인과 치운다 의존성 발현 벡터를 사용하여, 세부를 효율적으로 생체 내 이식 분석 전에 MGE 세포를 형질 도입하는데 사용되는 프로토콜 우리. 이 생체 내에서 크 셀형 특정 해상도를 허용하는, 이식 후 세포를 분산시키는 이들의 능력과 정확한 유전자 조작을 결합 때문에이 방법은 바람직하다.
서론
나머지는, 글루탐산 주요 신경 세포를 흥분에 해당하는 동안 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 포유류의 신피질에 신경 ~ 20 ~ 30 %를 포함한다. 의 interneurons는 전기 생리 학적 특성, 축삭과 수상 돌기의 형태와 1을 대상으로 시냅스 매우 다양하고, 흥분성 / 억제 톤의 불균형은 자폐증, 정신 분열증과 간질이 포함 신경 / 신경 정신 질환의 일부 표현형의 기초가 가설된다. 본원에 기술 된 프로토콜의 전반적인 목적은 효율적으로 유전자 분석을위한 생체 내 이식 전에 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 수정하는 수단을 제공하는 것이다.
대뇌 피질의 GABA 성에서의 interneurons는 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE 각각 CGE) 3,4뿐만 아니라 전핵 지역 5 태어난다. 두피 interneuron 전구 세포는 장거리 접선 마이그레이션이 다음 받다방사형 마이그레이션에 의해 최종 목표에 도달. 목적지에 도착하면,이 대뇌 피질의 interneurons 올바르게 기존의 신경 네트워크에 통합해야하며, 각각의 고유 interneuron 하위 그룹은 특정 방법으로 대뇌 피질의 회로에 기여할 것이....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 문 : 다음 절차는 우리의 기관과 동물의 프로토콜에 의해 승인되었습니다. 실험을 시작하기 전에 생존 수술과 관련된 모든 절차에 대한 승인을 얻을 수 있는지 확인하고 모든 프로토콜이 최신 확인합니다.
1. 렌티 준비 (선택적 단계)
- 10 ㎖의 DMEM / 10 % FBS의 존재 하에서 제조 될 각 렌티 대해 HEK293T 세포 세 10cm 플레이트를 분할하고, ~ 60 % ~ 70 % 합류로 성장한다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포를 성장.
- 1.2 μg의 pMD2.G이 (VSV-G를 인코딩) 1.2 (표 1에서 제공하는 DNA 벡터 순서) 6.4 μg의 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스 벡터, 다음 어떤 형질 시약을 사용하여 각 플레이트에 DNA 플라스미드 (10 μg의 총) 형질 μg의 pRSV 반전, 1.2 μg의 pMDLg / pRRE을. 세 렌티 바이러스 벡터를 패키징 시판되고있다 (표
참고 :이 특정 접근 방식은 3 세대 lentivir을 활용알 벡터하지만 2 세대 벡터 및 관련 플라스미드도 작동합니다. - 연락 또는 렌티 바이러스가 포함 된 용액 또는 장치를 불 활성화 BSL2 인증 후드 내에서 10 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
MGE 세포가 이주와 호스트 신피질 (16)에 이식 될 때 통합하는 독특한 능력을 가지고 있기 때문에, 이들은 생체 내 시험 전에 유전자 조작에 대한 우수한 모델 시스템을 제공한다. 여기서, 우리는 하나의 E13.5 태아로부터 MGE 조직을 분리하는 방법을 보여준다 (도 1 및도 2) 다음, 시험 관내 또는 생체 내 연구에 이식하기 전에 신속하게 하나 렌티 바이러스로 형질 도입 될 수있다. 렌티 바이러스를 통해 레이블 MGE는 GABA 성 뉴런 (15)에 GFP를 구동 인핸서를 사용하기 전에 수행되었습니다. 이식이 크게 이러한 세포 '분산과 통합의 연구를 도움이 될 수 전에 그러나, 능력은 이기종 인구의 특정 하위 그룹의 유전자를 표현. 여기서, 우리는 특정 서브 그룹 interneuron (SST) + 소마토스타틴을 발현있는 것에 형광 단백질의 발현을 대상으로하는 방법을 개발하기 위.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
세포 기반 치료를위한 배아 신경절 eminences (GE 나)에서 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체의 사용은 많은 조건 (12) -1 4 약속을 보이고있다. 정확한 분자 기법을 추적하고, 특정 interneuron 하위 그룹에 대한 관심의 유전자를 표현하기 위해 필요하다. 여기에서 우리는 이식하기 전에 렌티 바이러스로 배아 MGE 세포를 라벨에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고이 기술은 생체 분석을위한 특정 대뇌 피질의 interneuron 하위 그룹에 대한 관심의 유전자를 표현하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
본원에 기재된 프로토콜은 확실하지만, 최적의 재현성이 중요한 몇 단계에 부착하는 것이 필수적이며, 사용할 수있다. 바이러스의 형질 도입 효율성을 높일 수 먼저, 생리 학적 온도 및 pH는 필요하다. 이들 파라미터가 충족되면 MGE 세포 ~ 30 분 형질 도입 될 수있다. 둘째, 진행하기 전에 치밀한 MGE.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품에서 JLRR하는 보조금에 의해 지원되었다 : 자폐증은 언어, 니나 아일랜드, 웨스턴 항구 '재단, NIMH R01 MH081880 및 NIMH R37 MH049428을. PRW는 대만의 국립 과학위원회에서 친교에 의해 지원되었다. SFS는 F32 (MH103003)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MGE 세포 이식 1ml | |||
| 주사기 | REF | 309602 BD, Becton Dickinson 및 회사 | |
| 30 1/2 G 바늘 | 305106 | BD, Becton Dickinson 및 회사 | |
| 정밀 보어 5 µ l (플런저 포함) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| 붐스탠드가 있는 실체 현미경 ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| 단축 오일 유압 미세 미세 미세 조작기 ** | MO-10 | Narishige | |
| 다이아몬드 코팅 로터리 베벨러 | 집에서 | ||
| 바늘 피펫 풀러 | 730 | Kopf 기구 | |
| 미네랄 오일 | 모든 약국 또는 약국 | ||
| reliaby 측정 1 µ 할 수있는 모든 피펫 및 팁; 부피 | |||
| ** 이것들은 우리가 사용하는 특정 모델이지만 다른 많은 설정이 작동 | |||
| 선택적 시약(렌티바이러스 제조용) | |||
| 25 mm, 0.45 µ m 필터 | 09-719B | Fisher Scientific | |
| 초투명 원심분리기 튜브 (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| 기타 상용 공급품 | |||
| pMDLg/pRRE 플라스미드 인코딩 gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev 플라스미드 인코딩 Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G 플라스미드 인코딩 VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-플렉스-GFP | 28304 | 애드진 | |
참고문헌
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
