여기에서는 박테리아 단백질 HP-NAP의 항종양 효능을 평가하기 위해 정소성 방광 종양의 syngeneic mouse model을 설정하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
방광암은 비뇨생식관에서 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. 바실러스 칼메트-게린(BCG)의 방광 내 주사는 고급 비근육 침습성 방광암(NMIBC)에 대한 표준 치료법입니다. 그러나 치료 관련 부작용이 관련성이 있기 때문에 편익/부작용 비율이 더 나은 새로운 생물학적 반응 조절제가 필요합니다.
종양 미세환경은 종양 발달과 치료 효능 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 좋은 모델을 얻기 위해서는 암이 발생하는 기관에 종양 세포를 이식하는 것이 바람직합니다.
이 프로토콜에서는 암컷 마우스의 방광강에 종양을 형성하고 이후 치료제를 전달하는 방법을 설명합니다. 후자는 Helicobacter pylori 호중구 활성화 단백질(HP-NAP)을 사용하여 예시됩니다. 점막을 화학적으로 촬영한 후 요도 카테터 삽입을 통해 마우스 요로상피암 세포주 MB49를 주입하면 세포가 방광 점막에 부착할 수 있습니다. 세포의 초기 증식을 허용하는 데 필요한 일정 기간이 지난 후 마우스는 HP-NAP로 치료하고 카테터 삽입을 통해 다시 투여합니다. HP-NAP의 항종양 활성은 차량 및 HP-NAP 투여된 동물 간의 종양 부피, 괴사 정도 및 혈관화 정도를 비교하여 평가됩니다.
서론
방광암 USA 1 거의 75,000 매년 새로운 사례로, 비뇨 생식 관의 가장 흔한 암이다. 재발의 높은 비율은 방광암 치료하는 비싼 암 중 하나를 만드는 평생 추적 관찰을 필요로한다. 고급 NMIBC의 황금 표준 치료는 BCG와 방광 면역 다음, 트랜스 요도 절제술이다. BCG의 항 종양 활성의 정확한 메카니즘은 완전히 밝혀지지 그대로지만, 그것은 T 헬퍼 (토륨) (1) 및 세포 독성 T (TC) 한 세포가 풍부한 세포 매개 면역 반응의 활성화에 중요한 것으로 받아 들여 이 요법의 성공.
BCG는 NMIBC위한 선택의 처리는 남아 있다는 사실에도 불구하고, 치료에 반응하지 않는 환자의 높은 비율; 또한, 부작용의 수를 일으킬 수있다 : 처리 된 종양의 약 70 %의 근육 침습적 형태 ~ 15 %의 진행을 일정 시간 후 재발 및질병. BCG 치료와 관련된 다른 부작용은 배뇨 장애, 방광염, 신장 감염 3-6을 포함한다.
신규 한 치료 전략의 개발은 초기 시험 관내 평가 다음, 고려 전임상 모델을 사용한다; 이것은 누구의 미세 크게 치료에 자신의 개발 및 응답에 영향을 미칠 수있는 종양에 특히 관련이있다.
지난 10 년간, 우리는 HP-NAP, 헬리코박터 파일로리 균에 의해 생성 된 단백질의 면역 변조 활동의 여러 측면을 언급 한 초기 다형 핵 세포 (백혈구) (7)의 내피 부착을 촉진 할 수있는 것으로 확인. 구조적으로, HP-NAP는 공복 상태 (DPS) 가족 (8)에서 DNA를 보호하는 단백질에 속하고 dodecameric 쉘에 배치 (12)와 동일한 서브 유닛으로 구성되어 있습니다.
우리는 HP-NAP가 있음을 증명하고있다T의 분화를 구동 할 책임 강력한 면역 조절 활성을 갖는 수신자 같은 수용체 (TLR) 2 효능 제는 시험 관내 및 생체 내 9-10 모두에서, 한 Th1 표현형으로 림프구. 이 활동의 미덕에서, HP-NAP는 알레르기 성 천식 (11)의 쥐 모델에서 더 유리한받은 Th1 반응에 TH2 면역 반응을 리디렉션 할 수 있습니다.
HP-NAP의받은 Th1 종속 항 종양 가능성을 평가하기 위해 BCG 투여의 영향을 평가하기위한 O'Donnel 동료 (12)에 의해 수년 전에 개발 방광암의 마우스 모델을 이용했다.
이 프로토콜로, 우리는 HP-NAP는 방광암에 대한 강력한 항 종양 가능성을 가지고 및 HP-NAP 관리의 효능 (인터페론을 생산 모두받은 Th1과에 T 림프구의 종양 및 지역 림프절 내에서 상당한 축적을 평행을 입증 IFN)은 13 -γ SUP. HP-NAP-처리 된 마우스로부터 분리 된 종양을 더 괴사 미처리 대조 미만 혈관 신생을 나타내었다.
본 보고서는 동물의 준비, 그들의 요도 카테터, 방광 점막 세포의 부착을 위해 필요한 화학적 연소 및 종양 세포의 주입을 자세하게, stepbystep으로 프로토콜을 제공한다. 또한 방광암의 치료를 위해 개발 된 임의의 치료제의 원형으로 간주 할 수있는 HP-NAP의 국소 투여를 기술한다. 제어 및 HP-NAP 처리 된 동물로부터 분리 된 종양을 비교하여 얻은 증거는 단지 HP-NAP 방광 암 면역 요법을위한 좋은 후보뿐만 아니라 셋업 실험의 전반적인 효율성이 될 수 있다는 사실을 강조한다.
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프로토콜
동물 처리를위한 모든 절차는 건강의 이탈리아 교육부 (DM 2,011분의 204-B)에 의해 승인되었습니다.
1. 동물
- microisolation 필터를 개별적으로 환기 케이지 연령 8 주에 C57BL6 / J 여성 쥐를 성장.
참고 : 자신의 외부 URO-생식기 장치의 해부학 적 형태가 남성에 비해 카테터 쉽게 렌더링하기 때문에 여성이 바람직하다.
2. 세포 배양
- 가습 된 5 % CO 2에서 37 ° C에서 10 %의 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 및 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 마우스 urothelial 암종 세포주 MB49을 유지한다.
- 80 %의 합류에 T-75 플라스크에 MB49 세포를 성장. 를 Trypsinize 0.5 × 105에서 재현 탁 - 마우스에 이식하기 전에 PBS 150 μL 당 0.5 × 10 6 세포.
3. 방광 내 종양 임플란트
- (각각 33 ㎎ / ㎏ 및 20 ㎎ / ㎏)의 마취제 zoletil xylor과의 혼합을 사용하여 마우스를 마취, 복강 내 주사.
- 앙와위에서 동물을 놓고 스카치 테이프로 패드에 뒷다리를 해결. 앞발을 충분히 잘 표시하고 카테터의 삽입을 위해 용이하게 액세스 가능한 요도를 렌더링하기 위해 분리되어야한다.
- 참고 : 카테터를 들어, 24 G 소아 정맥 카테터는 8-10주 된 쥐에 적합합니다. 카테터의 선택은 요도 벽과 카테터 사이의 액 누설을 방지하기 위해 매우 중요하다. 큰 구멍 카테터는 큰 이상 마우스를 사용해야합니다.
- 작은 집게를 사용하여, 요도의 외부 부분 중 하나 가장자리를 끼와 마우스의 "머리 끝"으로 아주 조심스럽게 비틀. 이 작업은 요도를 노출합니다.
- 45 °의 각도로 요도에서 후자를 카테터의 내부 바늘을 제거하고 삽입 약간 지향마우스의 "꼬리 끝"으로. 카테터의 입구를 강요하지 마십시오 그 내부에 미끄러까지 요도 저항의 경우에는, 단지 매우 부드럽게 카테터 트위스트. 카테터의 약 0.5-0.8 cm가 요도에있을 때, 신중 마우스의 꼬리에 카테터를 병렬 배치하고 완전히 삽입.
- 카테터 삽입되어야하는 바늘의 1 mL의 주사기를 이용하여, 멸균 PBS의 200-300 μl를 주입하여 잔류 뇨로부터 방광을 씻어 방광에서 모든 액체를 흡인.
- 참고 : PBS를 주입하면 방광이 채워하고 붓기가 쥐의 뒷다리 사이에 볼 수 있습니다; 이 카테터가 올바른지 확인한다. 대부분 카테터 주입량을 계산할 때 고려되어야 데드 볼륨을 갖는다.
- 1 mL의 멸균 주사기를 사용하여, 0.1 N의 HCl 200 μl를 주입. 전체 벽을 레코딩하기 위해 방광을 입력합니다. 10 초 후, 모든 산을 제거하고 즉시 neutrali멸균 주사기와 0.1 N NaOH를 200 μl를 주입하여 ZE. 셀의 가장 높은 숫자 (0.5 × 106)의 주입시, 산성화 단계는 필요하지 않다.
- 기음 모든 잔류 액 즉시 멸균 PBS 300 μL와 공동을 세척.
- 방광 - (0.5 × 106의 범위는 0.5 × 10 5) 흡인 방광을 비우고, MB49 및 세포를 함유하는 PBS 150 μl를 주입. 세포의 누설을 방지하기 위해 카테터에 조립 주사기를 남겨. 이 스카치 테이프 패드를 고정하여 주사기를 고정하는 것이 좋다.
- 1 시간 후, 부드럽게로부터 요도 카테터를 추출하고 깨어까지 백열등, 케이지에서 마우스를 배치 이것은 보통 치료 종료 후의 1 ~ 2 시간이 발생한다.
HP-NAP 4. 방광 내 배달
- 주 : 셀 점안 후 최소 3 일, 그것은 시작하는 것이 가능하다치료.
- 단계 3.1-3.4에 설명 된대로 카테 테르를 꽂다. 이 단계에서, 그것은 HCl로 방광 벽을 구울 필요가 없습니다.
- 1 ML의 주사기를 사용하여 멸균 PBS의 200 ~ 300 μl를 주입하여 잔류 소변에서 방광 세척과 방광의 모든 액체를 대기음.
- 방광에 150 μL PBS 당 HP-NAP의 50 μg의를 주입한다. 단백질 용액의 누출을 방지하는 카테터에 부착 된 주사기를 남겨. 스카치 테이프로 패드에 고정하여 주사기를 고정합니다.
- 그들이 깨어 때까지, 백열 램프에서 1 시간 후, 부드럽게 요도에서 카테터를 추출하고 새장에 마우스를 놓습니다.
5. 종양의 Explants 및 조직 학적 분석
- 처리의 끝에서, 동물을 희생 누운 위치에 배치하고 스카치 테이프 패드를 고정 뒷다리.
- 외과 용 메스를 사용하여, 피부를 통해 약 1.52 cm 긴 수직 절개를복막 바로 마우스의 "헤드 엔드"외부 생식기 위에서 시작. 방광 손상의 위험을 최소화하기 위해, 절삭 깊이에 특히주의.
- 방광은 절단의 중앙 왼쪽에 배치되고 종양 어두운 핑크 / 바이올렛 질량으로 표시됩니다. 그 절제시, 조직 학적 새장에 전체 방광을 배치하고 파라핀에 삽입하기 전에 10 % 포르말린에 고정합니다.
- 조직 학적 및 면역 조직 화학적 분석을 위해, 표준 마이크로톰을 이용하여 방광 (46 μm의 두께)의 시리얼 섹션을 준비합니다.
- 헤 마톡 실린 / 에오신으로 섹션 얼룩과 종양 크기 (D XD는 2), 컴퓨터 보조 화상 분석기를 사용 단면적 당 괴사의 비율을 결정하는 계산을 진행.
- 용기 카운트, immunoperoxidase 표준 기술을 이용하여, 내피 세포 마커 CD31 / PECAM에 대한 부분을 염색하여 진행. 섹션을 스캔가장 높은 혈관 밀도의 영역을 식별하기위한 저전력 (× 4)를 t. 이 지역 내에서 높은 전력 (20 ×)에서 다섯 별도의 임의의 필드에서 개별 미세 혈관을 계산합니다.
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결과
도 1은 카테터 기법을 나타낸 것이다; 마우스는 카테터 0.5 × 10 6 MB49 세포를 주입한다. HP-NAP와 치료는 방광 벽에 부착하고 증식 할 수 있도록하기 위해 3 일 종양 세포의 주입 후 시작된다. 대조군에 속한 모든 동물들은 종양의 개발; 그들 중 일부는 의한 요도의 폐색에 13 일의 기간이 종료하기 전에 다이있다.
HP-NAP와 첫번째 주입 후에, 동물은 네 주사, 총 3 일마다 처리된다. 실험의 끝에, 열세 일에, 동물을 희생하고 블래 조직학 및 면역 조직 화학 분석을 위해 수집 하였다. 도 2a에 도시 한 바와 같이, HP-NAP - 처리 된 마우스에서 방광 내 종양의 부피는 830 ± 1 대 (220 ± 62mm 3 비히클 - 처리 된 마우스의 종양보다 훨씬 작80mm 3).
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토론
암 치료에서의 진보의 대부분은 임상 시험을 시작하기 전에 동물 모델에서 시험을 요구한다. 생체 내 종양 생물학을 연구 동물 모델을 활용 가능성이 다른 치료 적 접근 방식을 평가할 수있는 암 발병 조사 연구를위한 중요한 도구를 나타낸다. 동 소성 모델은 금본위 제 14 ~ 15을 유지, 모두 때문에 종양 모델을 설정하고 할 수 세포주의 거대한 양의가 자연적으로 발생하는 종양 (16)의 환경을 모방하기 때문이다.
여기에 기술 된 바와 같이, 후자는 xenoimplants를 거쳐 면역 결핍 마우스에서 가능하지 않기 때문에 또한, 동계 마우스에서 암의 동소 모델을 설정하는, 면역 요법에 기초하여 새로운 치료 전략을 조사하는 목적으로 연구의 경우에 특히 적합하다.
이 프로토콜에 묘사 된 방법은 T를 설명종양 세포의 접종 및 방광 공동 내로 치료제의 투여를 모두 허용 암컷 마우스 ...
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 Associazione Italiana의 당 라 Ricerca 술 Cancro, 대학의 이탈리아어 연구부, 인쇄용 프로젝트와 PROGETTI 디 Ricerca 디 아테네 오, 부여 N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo에 의해 지원되었다, N은 MDB에 2011-0485을 ° 및 Finanziamento 지오반니에 의해 부여 가이아 Codolo에 Studiosi, 파도바 대학.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 재료 | |||
| C57BL/6J 암컷 마우스 | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| 주사기 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (밀라노, 이탈리아) | 2% 자일라진 | |
| 졸레틸 | 비르박(카로스, 프랑스) | 359713301992 | 5% 졸라제팜 + 5% 틸레타민 |
| 24G 카테터 | 테루모(로마, 이탈리아) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba 시약(밀라노, 이탈리아) | 403871 | 액상 |
| NaOH | JT 베이커(미국 펜실베니아 센터 밸리) | 10095011 | 분말 |
| 장비 | |||
| 외과용 메스 | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
참고문헌
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Urol Clin North Am. 19, 565-572 (1992).
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
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