소형 조직 배양 시스템에서 마우스 심장 밸브를 배양

요약

여기에서는 쥐의 심장 판막을 배양할 수 있는 생체 외 흐름 모델을 제시하여 판막의 생물학을 연구할 수 있습니다.

초록

심장 판막 질환은 서구 세계에서 큰 부담이며 효과적인 치료법이 없습니다. 이는 주로 판막 구조의 유지 및/또는 손실의 기저에 있는 분자, 세포 및 기계적 메커니즘에 대한 지식이 부족하기 때문입니다.

판막 생물학을 연구하는 데 사용되는 현재 모델에는 판막 내피 및 간질 세포의 체외 배양이 포함됩니다. 체외 배양 모델은 세포 및 분자 메커니즘을 모두 제공하지만 판막의 3D 조직과 관련된 메커니즘은 불분명합니다. 생체 내 모델은 판막 발달의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했지만, 성인 판막 생물학에 대한 통찰력은 여전히 파악하기 어렵습니다.

조직, 세포 및 분자 수준에서 판막 3D 조직의 조절을 연구할 수 있도록 우리는 미니어처 조직 배양 시스템을 개발했습니다. 이 체외유동 모델에서는 승모판 또는 대동맥 판막이 심장의 자연스러운 위치에서 배양됩니다. 첨판의 자연스러운 구성과 구성이 유지되어 판막 세포가 자극에 가장 자연스럽게 반응할 수 있습니다. 밸브는 실행 가능한 상태를 유지하며 변화하는 환경 조건에 반응합니다. 이 MTCS는 3D 조직이 판막 생물학에 어떤 영향을 미치는지, 어떤 요인이 판막의 3D 조직에 영향을 미치는지, 어떤 신호 경로 네트워크가 판막의 3D 조직을 조절하는지 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 질문을 연구하는 데 이점을 제공할 수 있습니다.

서론

심장 판막 질환은 서구 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인이다 그 유병률은 연령에 따라 증가하며 75년 인구의 10 % 이상 및 ¹ 이전에 영향을 미친다. 마음의 전신 부분의 밸브는, 대동맥 및 승모판 밸브는 주로 영향을받습니다. 심장 판막 질환 ^(2)의 기계적 특성 변화를 초래 밸브의 고도로 조직화 구조의 손실을 특징으로한다. 구조적 완전성은 밸브의 기능에 따라서 중요하다.

밸브의 전단지는 판막 간질 세포 (VIC), 판막 내피 세포 (VEC), 고도로 계층화 된 패턴 ^3,4으로 구성되어 세포 외 매트릭스로 구성되어있다. VIC를은 전자 재료 합성, 분해 및 조직에 대한 책임이 있습니다. 요인은 혈액, 내장 컴퓨터에서 나오는 또는 그 기능을 조율 VIC를에 ECM 행위에 거주. 또한,기계적 힘은 층류 또는 진동형 전단 응력, ^{VIC를도 5의} 동작에 영향을주는 압축 또는 인장 응력을 초래 심장주기 동안 전단에 작용.

밸브의 구조를 조절하는 방법을 이해하기 위해서는, 먼저 VIC를가 심장 사이클 동안 경험 한 자극의 다양한 세트에 응답하는 방법을 이해하여야한다. 시험 관내 연구 판막 세포의 특성....

프로토콜

이 프로토콜은 동물 연구 윤리위원회의 LUMC 지침을 따른다.

악기 1. 준비, 문화 매체, 및 MTCS

참고 : 층류 후드에있는 모든 준비를 수행합니다. MTCS 관류 실, 버블 트랩 및 스탠드 리버 등. 2010 년 ^(11)에 설명되어 있습니다.

1. 70 % 에탄올로 포셉 및 마이크로 가위를 소독. 멸균 타이로드의 버퍼 (130 mM의 염화나트륨, 5.4 밀리미터의 KCl, 6.0 mM의 헤 페스, 1.2 mM의 _황산, 1.2 21G 바늘 5 ML의 주사기를 준비 mM의 KH ₂ PO _4, 20 mM의 포도당, 1.5 mM의 염화칼슘 ₂ · 2H ₂ O, 의 pH = 7.2). 무균의 KCl 용액 (100 mM의)와 21G 바늘 5 ML의 주사기를 준비합니다.
2. 65 심장 당 매체 ml의 준비 : (A /; 페니실린의 100 단위, 100 스트렙토 마이신의 μg의, 및 암포 테리 신 B의 0.25 UG / ㎖) DMEM 10 % 태아 송아지 혈청, 안티 곰팡이 / 항생제로 보충을, 인슐린 Transferrin-셀레늄 (I....

결과

대동맥 판막 (그림 2) 또는 승모판 막 ^(11)은 최소 3 일 동안 배양 할 수있다. (대동맥판과 승모판 대한 확장기의 총수에 대한 수축기 위치를 나타낸다)가 개방 위치에서 배양함으로써, 판막 세포 생존 유지. TUNEL 양성 세포 (도 2H, I) 또는 절단 된 카스파 제 -3 발현의 부재에 의해 결정된 어떠한 세포 사멸이 관찰되지 않는 (도시되지 리버 외., 2010 ^(11)). (AS의 메이슨 트리 크롬 염색으로 시각화)의 콜라겐 분포는 1 % 혈청 (도 2D, E)에서 배양 기본 조건과 유사하다. 밸브는 배양 조건의 변화에​​ 응답한다. 두꺼운 전단에서 10 %의 결과 (도 2c)에 혈청의 양을 증가시킨다. 또한, 투명한 콜라겐없는 영역이 대동맥 벽에 부착 근처 전단지의 심실 측면에서 관찰된다 (그림 2 층에 화살.......

토론

심장 마우스 밸브를 배양에서 중요한 단계는 흐름의 적절한 방향을 보장하기 위해 마우스에서 심장 절제 밸브에 수직 바늘의 생존과 라이 게이션을 위해 가능한 한 짧은 관류 챔버에서 결찰 사이의 시간을 포함 . 또한, 매체없이 관류 챔버에서 결찰 후 흐름을 확인하는 것은 적절한 삽입 및 바늘의 결찰을 보장합니다. 그것은 멸균 문화를 유지하고 잠재적으로 흐름을 방해 마음에 갇혀 얻을 수있는 튜브에 공기 방울을 방지하는 것이 중요합니다.

심장의 재관류에 사용되는 매체의 총 부피가 45 ml 인 것을 (심장을 통해 관류 매체 관류 챔버에서 매질의 20 ㎖에 접촉하지 않는다). 예는 작은 볼륨에 대한 바이러스의 추가가 바람직 할 수있다. 일시 저장조 (및 배관의 일부) 회로 (L)로부터 제거 될 수있다시스템 5-7 mL로 eaving 것은 밸브의 감염을 허용한다.

심장의 박동의 부재는 제한이 고려 될 수있다. 그러나, 전단 작업 모든 자.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
둘베코' s Modified Eagle Medium	Life Technologies	10569-010
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140
인슐린-트랜스페린-셀레늄	Life Technologies	41400-045
항생제-항진균	Life Technologies	15240-06
실크 7-0	Ethicon	768G
100mm 배양 접시	Greiner 바이오 원	664160
50ml 튜브	Greiner 바이오 원	227261
5ml 주사기	BD	309649
21G 바늘	BD	304432
헤파린	LEO	012866-08
집게	파인 사이언스 도구	11295-00
마이크로 가위, 경제, Vannas-type	Tedpella	1346
실리콘 튜빙	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x 벽: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
펌프용 실리콘 튜빙	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x 벽: 0.8 x1.59 x 0.40 mm
생체 적합성 접착제 (Histoacryl)	B. Braun	1050071
정밀 기화기	Drä ger	Vapor 200
연동 롤러 펌프	Masterflex	7521-35
이지 로드 펌프 헤드	Masterflex	7518-00
플로우 챔버			Lieber et al., 2010
버블 트랩			Lieber et al., 2010 참조