약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

요약

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

초록

암세포 스페로이드는 항암제 검사 응용을 위한 유의미한 무혈관 종양의 체외 모델을 제시합니다. 이 작업에는 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 단일 배양 및 공동 배양 스페로이드를 모두 생산하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 접근법은 수성 2상 시스템을 사용하여 세포를 두 번째 수성 상 내에 침지된 더 밀도가 높은 수성 상의 한 방울로 제한합니다. 방울은 웰 표면에 놓이고 세포를 근접하게 유지하여 단일 스페로이드를 형성합니다. 이 기술은 크기 제어 스페로이드를 생산하고 화합물 스크리닝 응용 분야를 위한 스페로이드 생산 프로세스를 촉진하기 위해 로봇 액체 처리기에 적용되었습니다. 임상적으로 사용되는 약물로 처리된 스페로이드는 약물 투여량이 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났습니다. 스페로이드 생성을 위해 표준 마이크로 웰 플레이트를 사용하면 마이크로 플레이트 리더로 약물 처리된 스페로이드의 암세포 생존력을 간단하게 분석할 수 있습니다. 이 기술은 로봇으로 구현하거나 수동 파이펫과 같은 다른 액체 취급 도구와 함께 간단하게 구현할 수 있습니다.

서론

세포 기반 분석법을 개발 및 새로운 항암 약물의 발견을위한 중요한 도구를 제공한다. ^1,2 역사적으로, 암 세포의 단층 배양 물은 암 세포의 특정 유형에 대한 후보 화합물의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. 표준 배양 플레이트에 단층 문화의 유지 보수의 용이성, 시약을 첨가 한 상용 로봇 도구와 표준 플레이트의 호환성 및 화학 물질에 대한 세포 반응의 다운 스트림 분석을위한 검사 장비와는 2D 문화에게 매력적인 도구를 렌더링의 주요 장점은 약물 테스트를 위해. ³ 불행하게도, 단층 세포 분석은 종종 신약 개발과 발견을 매우 비용이 많이 드는 과정을, 생체 내에서 화합물의 효능을 예측하지 못한다. ^4,5 제약 회사 학술 단위, 만 ~ 1 %로 상당한 투자와 노력에도 불구하고 항암제의 임상 시험에서 약물이 승인되었다지난 20 년간 FDA에 의해. 차원 배양 및 생체 내에서 암세포의 복잡한 3D 환경 사이 ⁶ 격차가 단층 배양 시스템의 주요 단점이다. ⁽⁷⁾ 따라서, 설정에서 종양 세포에 대한 후보 화합물 스크리닝은 더 밀접하게 닮았다 3D 종양 환경은 새로운 화학 요법 약물의 개발을 촉진 할 수있다. ⁽⁸⁾

프로토콜

고분자 수성 2 단계 시스템 1. 준비 (ATPS)

1. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (MW : 35,000) 0.5 g을 달아 수성 PEG 단계 (/ V W) 5 % 10 ㎖를 제조 멸균 15ml의 원뿔에서 완전 성장 배지 9.5 ml의 추가.
   주 : 제 중합체를 추가하고 그 다음에 원뿔형 배지의 절반을 추가하는 것은 그 다음 매체의 잔량이 원추형 벽 중합체의 접착 성을 최소화하고, 중합체가 더 빨리 용해 돕는다.
2. 덱스 트란 (DEX) 0.128 g (MW : 500,000)를 달아 12.8 % (w / v)의 수용액 DEX 상 1 ㎖를 제조 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 완전 성장 배지의 0.872 ml의 추가.
3. 약 1 분 동안 와동 두 솔루션 배지에서 중합체를 용해.
4. 용해 및 균질 혼합물을 보장하기 위해 1 시간 동안 37 ℃에서 수욕에서 두 솔루션 유지. 목욕의 솔루션의 오염 가능성을 방지하기 위해 물 수준의 위 뚜껑을 유지물.
5. 멸균 플라스틱 주사기 내로 PEG 상 용액을로드 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터를 통해 전달한다.
   천천히 필터를 통해 솔루션을 밀어, PEG 용액을 주사기를 채우기 원뿔 튜브의 상단과 힘을 사용하는 방법....

결과

로봇 액체 핸들러의 워크 스테이션. 그림 1의 피펫 팅 헤드와 4.6에서 타원체의 로봇 인쇄에 사용 된 모든 방송국이 표시되어있다. 이미지는 팁 상자에 대한 두 개의 서로 다른 스테이션 (한 믹싱 팁 세트와 세포 현탁액 수성 DEX 상 혼합물의 / 분배를 흡입에 대한 두 번째 세트)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 전체 셋업은 무균 상태를 유지하기 위해 표준 생물학적 안전 캐비닛 내에 수납된다. 2 개의 상, 수성 시스템 "인쇄"프로세스의 개략적 인 도표를 나타낸다. 수성 DEX 단계 (블루, 패터닝 단계)에서 세포 현탁액 로케이션 피펫 팁은 가까이에 그 콘텐츠를 분배하도록 수성 PEG 단계 (핑크, 침지 단계)를 함유하는 96 웰 플레이트의 둥근 바닥 웰 내로 하강 잘 바닥. 얻어진 DEX 위상 강하 확산되는 암세포를 제한하고 결과 세포 - 세포 상호 작용을 촉진세포 및 회전 타원체 형성 응집. 회전 타원체 형성은

토론

스페 로이드 잘 종양 생리학 및 약물 효능을 이해하고 항암 약물 개발을위한 유용한 도구를 제공하는 실제적인 모델을 제시한다. 이러한 응용 프로그램은 크게 만 표준 실험 실용 액체 처리 도구 및 선별 장비를 필요로 간단한 회전 타원체 생성 및 유지 보수 기술 혜택을 누릴 것입니다. 수성 개의 상 시스템 드롭 위상 내로 자발적 집합체 암세포의 사용은 효율적인 생산과 로봇 액체 핸들러 타원체의 유지, 및 인 시츄 약물 치료 및 상업적인 시약 및 도구 세포 반응의 종점 분석을 허용한다. 따라서,이 기술의 주요 장점은 3D 암 세포 배양의 기존 접근 방식을 통해이며, 신약 개발을 촉진 할 수있는 검사 플랫폼을 제공한다.

마이크로 웰 플레이트 내에서 균일 한 크기의 타원체를 생성하면 유사한 기준 셀룰러 교류를 보장하기 위해 높은 처리량 검사 애플리케이션을위한 매우 중요하다모든 타원체에 tivity 수준. 공기 변위 피펫 팅기구 액체 핸들러를 사용하여, 상.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, MW: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
소 태아 혈청	Sigma-Aldrich	12306C
글루타민	라이프 테크놀로지	35050-061
항생제	라이프 테크놀로지	15240-062
클라세인 AM	라이프 테크놀러지	C3100MP
Hoechst	라이프 테크놀러지	33342
시스플라틴	스펙트럼 케미컬	15663-27-1
프레스토블루	라이프 테크놀로지	A-13261
Pluronic F-108	시그마 알드리치	542342
일회용 팁 (10 &마이크로; l)	형광	C-P10V11.ST
일회용 팁 (70 µ l)	Fluotics	C-P70V11.ST
둥근 바닥 96 웰 플레이트	Nunc	268200
Equipment< / strong>
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M

스 스 스