특정 DNA 표지 methyl green을 가진 고정된 생물학적 물질의 형광 염색 방법이 설명되어 있습니다. 메틸 그린은 희석 된 수용액에 사용되며 광 표백에 매우 강합니다. 원적외선 방출로 표본 심층 이미징이 가능하여 전체 배아에 특히 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Methyl green은 DNA에 대한 특정 친화력을 가진 조직학적 염색으로 오랫동안 알려져 왔지만 최근까지 형광 특성은 탐구되지 않았습니다. 이 기사에서는 메틸 그린 수성 원액을 제조하는 방법을 설명하며, 희석하면 고정 세포 및 조직에 대한 매우 편리한 형광 핵 표지로 사용할 수 있습니다. 전체 제브라피시 및 병아리 배아를 라벨링하는 쉬운 절차가 자세히 설명되어 있으며 얻은 이미지의 예가 표시됩니다. 메틸 그린은 633nm에서 적색광에 의해 최대로 여기되고 677nm에서 최고조에 달하는 비교적 선명한 스펙트럼으로 방출합니다. 매우 저렴하고 무독성이며 용액에서 매우 안정적이며 DNA에 결합 될 때 광표백에 매우 강합니다. 적색 방출은 두꺼운 표본의 핵에 대한 변경되지 않은 고해상도 스캐닝 공초점 이미징을 가능하게 합니다. 마지막으로, 이 메틸 그린 염색 프로토콜은 항체 라벨링 또는 형광단 접합 팔로이딘을 사용한 액틴 필라멘트 라벨링과 같은 다른 세포 염색 절차와 호환됩니다.
서론
DNA의 형광 염색은 핵 및 염색체 구조에 대한 자세한 연구, 조직 및 세포 염색 또는 세포주기 매개변수 연구1을 위해 생물학 연구와 임상 진단 모두에서 광범위하고 일상적으로 사용됩니다. 여러 가지 DNA 염색을 사용할 수 있지만 가장 널리 사용되는 것은 자외선에 의해 여기되고 파란색으로 방출되는 염색으로, 형광 단백질 또는 항체에 부착된 작은 분자와 같은 녹색 및 주황색-적색 방출 형광단과 결합할 때 대부분의 기존 에피 형광 현미경에 사용되는 일반적인 3 필터 시스템에 적합합니다. 이러한 청색 방출 DNA 염색 중 가장 흔한 것은 DAPI 및 Hoechst 미량 홈 결합제입니다2,3. 그럼에도 불구하고 레이저 스캐닝 현미경에 다양한 레이저 방출선과 스펙트럼 검출이 통합됨에 따라 연구자들은 요오드화프로피듐(PI) 또는 TO-PRO 34와 같은 원적외선 방출 핵 염색제의 사용을 선택할 수 있게 되었습니다. 이러한 염색의 장점은 많은 세포와 조직, 특히 배아에서 발견되는 자가형광 문제를 극복한다는 것입니다5 그러나 이들 중 다수는 방출 프로파일이 넓거나 광표백에 매우 민감합니다6 .
스위스의 연구원 프리드리히 미셔(Friedrich Miescher)....
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프로토콜
염료 1. 정제
- 증류수 10ml에 얼룩 분말 0.4 g을 용해시켜 메틸 녹색의 4 % 수용액을 준비합니다. 완전히 용해 될 때까지 잘 섞는다.
- 흄 후드에서 클로로포름 중 적어도 2 부분으로 섞는다. 그것은 튜브 클로로포름 내성 여부를 사전에 확인하는 것이 중요합니다.
- 철저하게 믹스와 상 분리를 가속화하기 위해 2,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리.
- 원심 분리 후, 메틸 녹색 상부 수 성상을 클로로포름으로 하부 유기상과 일반적인 오염물 크리스탈 바이올렛이 얻어진다.
- 위의 위상을 복구하고 낮은 단계는 크리스탈 바이올렛의 완전히없는 나타날 때까지이 단계를 반복합니다.
- 마지막에, 상부 상을 회수하고, 2 % 메틸 그린의 최종 농도로 물에 희석 하였다. 이 원액 개월 작업대에 안정하고 빛으로부터 보호 될 필요가 없다.
2. 전체 Zebrafish의 태아의 형광 핵 염색은 메틸 녹색을 사용하여
- 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (파라 포름 알데히드)에서 하룻밤에 4 % 포름 알데히드 배아를 수정.
참고 :이 몇 시간 걸릴 수 있습니다 하룻밤 배아의 두께에 따라합니다. 예를 들어, 우리는 밤새 4....
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결과
두꺼운 시편의 핵 염색. 여기에 설명 된 프로토콜은 전체 배아 깊은 구조의 균일 한 염색의 달성을 허용한다. 개발 렌즈 핵 양식 (48) HPF 제브라 피쉬 배아 균일 (그림 1) 표시되어 있습니다.
메틸 녹색 DNA 염색은 유사 분열 또는 세포 사멸 핵 (그림 2A)의 식별로 세포주기에 의존 형태 학적 차이의 차별을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 (그림 2B)의 표피 핵에 대한 그림과 같이 높은 해상도에서 Subnuclear 구조도 분명 있습니다.
메틸 녹색이 장시간 고휘도로 조사시 photobleaching에 강하다. 동일한 강도로 633 nm의 레이저 광을 조사 할 때 또 다른 특정 DNA 염색 공유 유사한 스펙트럼 특성의 경우는 TO-PRO-3이므로, 메틸 녹색 핵 염색 아웃 표백하지4. 전체 장착 지브라 피쉬 배아 망막의.......
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토론
형광 현미경의 변형에 특히 초점을 맞춘 지난 수십 년 동안 현미경 기술의 점진적인 발전으로 인해 전체 배아를 포함한 온전한 조직 샘플의 역학과 구조를 탐구할 수 있는 가능성이 생겼습니다10,11. 그러나 한 가지 주요 한계는 세포 내 구조를 직접적이고 신속하게 염색하는 데 사용할 수 있는 양질의 형광단을 사용할 수 있다는 것입니다.
DAPI 또는 Hoechst와 같이 가장 자주 사용되는 형광 DNA 염색은 UV 광선으로 여기되어 가시 스펙트럼2,3의 파란색 영역에서 방출되므로 전체 조직의 심부 구조를 이미징하는 데 부적절합니다. 적색광은 생물학적 샘플에 훨씬 더 잘 침투하므로 적색 발광 형광단이 이러한 연구에 더 적합하게 됩니다12. 자가형광은 적색 발광 형광단을 사용하여 극복할 수 있는 배아 조직의 일반적인 문제입니다5.
우리는 매우 흔한 조직학적 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 비디오 제작을 담당한 Patxi Jaso에게, PEDECIBA와 부분 자금 지원을 제공한 ANII(Agencia Nacional de Investigación e Innovación)에 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
| 메틸 그린 | Dr. G. Grü bler | 는 또한 Sigma-Aldrich 323829를 테스트했는데, 이는 크리스탈 바이올렛이 없는 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Leica TCS-SP5 Leica | Microsystems | ||
| Phalloidin– 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이 | 트 시그마-알드리치 | P1951 | |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| 현미경 슬라이드 | Deltalab | D100004 | |
| 커버 슬립 | Esco 광학 | R525025 |
참고문헌
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Lat....
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재인쇄 및 허가
