방법 논문

배아의 형광 라벨의 DNA 특정 얼룩 메틸 녹색의 응용 프로그램

DOI:

10.3791/52769

⸱

2015년 5월 2일

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Montevideo, 2Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

이 논문에서

요약

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특정 DNA 표지 methyl green을 가진 고정된 생물학적 물질의 형광 염색 방법이 설명되어 있습니다. 메틸 그린은 희석 된 수용액에 사용되며 광 표백에 매우 강합니다. 원적외선 방출로 표본 심층 이미징이 가능하여 전체 배아에 특히 적합합니다.

초록

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Methyl green은 DNA에 대한 특정 친화력을 가진 조직학적 염색으로 오랫동안 알려져 왔지만 최근까지 형광 특성은 탐구되지 않았습니다. 이 기사에서는 메틸 그린 수성 원액을 제조하는 방법을 설명하며, 희석하면 고정 세포 및 조직에 대한 매우 편리한 형광 핵 표지로 사용할 수 있습니다. 전체 제브라피시 및 병아리 배아를 라벨링하는 쉬운 절차가 자세히 설명되어 있으며 얻은 이미지의 예가 표시됩니다. 메틸 그린은 633nm에서 적색광에 의해 최대로 여기되고 677nm에서 최고조에 달하는 비교적 선명한 스펙트럼으로 방출합니다. 매우 저렴하고 무독성이며 용액에서 매우 안정적이며 DNA에 결합 될 때 광표백에 매우 강합니다. 적색 방출은 두꺼운 표본의 핵에 대한 변경되지 않은 고해상도 스캐닝 공초점 이미징을 가능하게 합니다. 마지막으로, 이 메틸 그린 염색 프로토콜은 항체 라벨링 또는 형광단 접합 팔로이딘을 사용한 액틴 필라멘트 라벨링과 같은 다른 세포 염색 절차와 호환됩니다.

서론

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DNA의 형광 염색은 핵 및 염색체 구조에 대한 자세한 연구, 조직 및 세포 염색 또는 세포주기 매개변수 연구1을 위해 생물학 연구와 임상 진단 모두에서 광범위하고 일상적으로 사용됩니다. 여러 가지 DNA 염색을 사용할 수 있지만 가장 널리 사용되는 것은 자외선에 의해 여기되고 파란색으로 방출되는 염색으로, 형광 단백질 또는 항체에 부착된 작은 분자와 같은 녹색 및 주황색-적색 방출 형광단과 결합할 때 대부분의 기존 에피 형광 현미경에 사용되는 일반적인 3 필터 시스템에 적합합니다. 이러한 청색 방출 DNA 염색 중 가장 흔한 것은 DAPI 및 Hoechst 미량 홈 결합제입니다2,3. 그럼에도 불구하고 레이저 스캐닝 현미경에 다양한 레이저 방출선과 스펙트럼 검출이 통합됨에 따라 연구자들은 요오드화프로피듐(PI) 또는 TO-PRO 34와 같은 원적외선 방출 핵 염색제의 사용을 선택할 수 있게 되었습니다. 이러한 염색의 장점은 많은 세포와 조직, 특히 배아에서 발견되는 자가형광 문제를 극복한다는 것입니다5 그러나 이들 중 다수는 방출 프로파일이 넓거나 광표백에 매우 민감합니다6 .

스위스의 연구원 프리드리히 미셔(Friedrich Miescher)는 1869년에 고름에서 발견되는 백혈구의 핵에서 DNA를 추출하는 DNA를 발견했다. 그는 그것을 뉴클레인(nuclein)이라고 불렀고, 몇 년 후에 그것이 비교적 새로운 염색인 메틸 그린(methyl green)으로 침전물을 형성한다는 것을 보여주었다. 메틸 그린은 메틸화 정도가 다른 3 개의 아닐린 고리로 구성되며 DNA7,8의 주요 홈에 강하게 결합 할 수있는 두 개의 양전하를 가지고 있습니다. 메틸 그린에 의한 DNA 염색은 매우 초기에 특이적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 Unna와 Pappenheim에 의해 RNA를 특이적으로 표지하는 pyronin과 결합된 염색의 개발로 이어졌습니다. 그 이후로 메틸 그린-피로닌(methyl green-pyronin)은 일상적인 조직학 기법에 광범위하게 사용되었다9.

최근까지 메틸 그린의 형광 특성에 대해 알려진 바는 거의 없었습니다. 그러나 우리의 이전 연구는 633 nm에서의 여기, 편리한 스톡스 이동, 전자기 스펙트럼의 근적외선 부분에서의 방출, 유사한 스펙트럼 특성을 가진 상업적으로 이용 가능한 DNA 염색보다 높은 광안정성과 매우 저렴한 비용과 같은 메틸 그린 스펙트럼 장점6 중 일부를 발견했습니다. 이것이 우리가 배아 조직과 전체 배아에서 DNA에 대한 매우 높은 친화력 및 특정 형광 표지로 사용되는 것을 테스트하기로 결정한 이유입니다. 더욱이, 지금까지는 메틸 그린 핵 염색이 낮은 pH에서 행해졌기 때문에, 항체 염색과의 결합이 어려웠다. 여기에 자세히 설명된 방법의 목표는 생리학적 pH에서 염색 절차를 수행하여 앞서 언급한 불편함을 극복하는 형광 핵 DNA 염색을 위한 프로토콜을 확보하여 단면 및 전체 조직에 대한 면역 표지에 적합한 대조염색을 하는 것입니다.

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프로토콜

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염료 1. 정제

  1. 증류수 10ml에 얼룩 분말 0.4 g을 용해시켜 메틸 녹색의 4 % 수용액을 준비합니다. 완전히 용해 될 때까지 잘 섞는다.
  2. 흄 후드에서 클로로포름 중 적어도 2 부분으로 섞는다. 그것은 튜브 클로로포름 내성 여부를 사전에 확인하는 것이 중요합니다.
  3. 철저하게 믹스와 상 분리를 가속화하기 위해 2,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리.
  4. 원심 분리 후, 메틸 녹색 상부 수 성상을 클로로포름으로 하부 유기상과 일반적인 오염물 크리스탈 바이올렛이 얻어진다.
  5. 위의 위상을 복구하고 낮은 단계는 크리스탈 바이올렛의 완전히없는 나타날 때까지이 단계를 반복합니다.
  6. 마지막에, 상부 상을 회수하고, 2 % 메틸 그린의 최종 농도로 물에 희석 하였다. 이 원액 개월 작업대에 안정하고 빛으로부터 보호 될 필요가 없다.

2. 전체 Zebrafish의 태아의 형광 핵 염색은 메틸 녹색을 사용하여

  1. 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (파라 포름 알데히드)에서 하룻밤에 4 % 포름 알데히드 배아를 수정.
    참고 :이 몇 시간 걸릴 수 있습니다 하룻밤 배아의 두께에 따라합니다. 예를 들어, 우리는 밤새 48 시간 후 수정 (HPF) 제브라 피쉬 배아를 고정.
  2. 5 분 동안 PBS-T (PBS에 1 % 트리톤 X-100)에 배아를 세 번 씻으십시오. 세제의 상승 된 농도는 표피를 permeabilizes.
  3. 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 배양시 세제의 존재는 제브라 피쉬 배아 및 유충 두꺼운 시편에 유용합니다.
  4. 부드럽게 흔들와, 4 ° C에서 적어도 6 시간 동안 용액에서 배아를 인큐베이션. 또, 배아의 두께는 배양 길이 교정 파라미터이다.
  5. 배아 3 팀을 씻으십시오30 분 동안 PBS로 ES는 세제 초과를 제거합니다. DNA에 결합시 메틸 녹색 형광 만 명백하고, 결합되지 않은 분자로부터 따라서 백그라운드는 무시할 수있다.
  6. 발굴 슬라이드 또는 설치 솔루션을 만든 실에 산 (75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 · 염산의 pH 8).
    참고 : 핵 염색이 immunolabeling 이후에 수행 될 경우, 메틸 녹색이 그것을 씻어 할 필요없이, 작업 농도 장착 솔루션에 통합 할 수 있습니다.
  7. 스토어 냉장 또는 즉시 영상을 시작합니다. 650-750 nm의 녹색의 발광은 677 nm에서 최대가 상기 메틸 고려에 등록 설정 및 633 nm의 방출 필터와 함께 여기에 레이저 스캐닝 공 초점 (또는 다른 형광) 현미경으로 촬영을 수행한다.
    주 : 우리는 메틸 녹색 발광 프로파일의 측정 데이터, 보충 자료로서 수집 소프트웨어에로드 될을 제공한다.

3. 형광 핵 세인트메틸 녹색을 사용하여 항목의 병아리 태아의 aining

  1. 관심의 단계로 수정 된 암탉이 알을 품어. 4 ℃에서 하룻밤 PBS에서 (파라 포름 알데히드)에서 4 % 포름 알데히드의 배아를 수정. 2 시간 동안 PBS-T에서 배아 3 회 반복한다.
  2. 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 염색 액에 배아를 품어. 배아에게 PBS 3 회, 1 시간 각을 씻으십시오. 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스, pH가 8 실의 산.

4. 이미지 찬란는 전체 마운트 배아에서 핵을 레이블

  1. 조심스럽게 현미경 슬라이드를 통해 전기 테이프의 여러 층을 고집에 의해 영상 실 준비는 내 배아를 배치 메스로에 구멍을 잘라. 이 영상 중에 분쇄에서 배아를 방지 할 수 있습니다.
  2. 조심스럽게 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 -HCl, pH가 8 위로 챔버 촬상 챔버 배아를 전송하고 채우기무효 거품 형성.
  3. # 0 커버 슬립은 피하거나 매체 넘치는 제거와 커버. 매니큐어와 인감.
  4. 여기 필터 (633) 또는 레이저 라인을 구비 한 형광 현미경에서 시료의 이미지를 수집.
    참고 : 배출 필터는 메틸 녹색의 677 방출 최대를 포함해야한다.

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결과

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두꺼운 시편의 핵 염색. 여기에 설명 된 프로토콜은 전체 배아 깊은 구조의 균일 한 염색의 달성을 허용한다. 개발 렌즈 핵 양식 (48) HPF 제브라 피쉬 배아 균일 (그림 1) 표시되어 있습니다.

메틸 녹색 DNA 염색은 유사 분열 또는 세포 사멸 핵 (그림 2A)의 식별로 세포주기에 의존 형태 학적 차이의 차별을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 (그림 2B)의 표피 핵에 대한 그림과 같이 높은 해상도에서 Subnuclear 구조도 분명 있습니다.

메틸 녹색이 장시간 고휘도로 조사시 photobleaching에 강하다. 동일한 강도로 633 nm의 레이저 광을 조사 할 때 또 다른 특정 DNA 염색 공유 유사한 스펙트럼 특성의 경우는 TO-PRO-3이므로, 메틸 녹색 핵 염색 아웃 표백하지4. 전체 장착 지브라 피쉬 배아 망막의...

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토론

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형광 현미경의 변형에 특히 초점을 맞춘 지난 수십 년 동안 현미경 기술의 점진적인 발전으로 인해 전체 배아를 포함한 온전한 조직 샘플의 역학과 구조를 탐구할 수 있는 가능성이 생겼습니다10,11. 그러나 한 가지 주요 한계는 세포 내 구조를 직접적이고 신속하게 염색하는 데 사용할 수 있는 양질의 형광단을 사용할 수 있다는 것입니다.

DAPI 또는 Hoechst와 같이 가장 자주 사용되는 형광 DNA 염색은 UV 광선으로 여기되어 가시 스펙트럼2,3의 파란색 영역에서 방출되므로 전체 조직의 심부 구조를 이미징하는 데 부적절합니다. 적색광은 생물학적 샘플에 훨씬 더 잘 침투하므로 적색 발광 형광단이 이러한 연구에 더 적합하게 됩니다12. 자가형광은 적색 발광 형광단을 사용하여 극복할 수 있는 배아 조직의 일반적인 문제입니다5.

우리는 매우 흔한 조직학적 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 비디오 제작을 담당한 Patxi Jaso에게, PEDECIBA와 부분 자금 지원을 제공한 ANII(Agencia Nacional de Investigación e Innovación)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
글리세롤시그마-알드리치G5516
메틸 그린Dr. G. Grü bler는 또한 Sigma-Aldrich 323829를 테스트했는데, 이는 크리스탈 바이올렛이 없는
파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Leica TCS-SP5 LeicaMicrosystems
Phalloidin– 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트 시그마-알드리치
P1951 
클로로포름Sigma-Aldrich372978
Centrifuge 5810 Reppendorf5811 000.010   
현미경 슬라이드DeltalabD100004
커버 슬립Esco 광학R525025

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).

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