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방법 논문

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

13.8K 조회수

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DOI:

10.3791/52782

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2015년 5월 3일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

이 논문에서

요약

세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.

초록

동물, 식물 및 단일 세포로부터 세포 외부로부터 세포질을 분리 세포막라는 장벽에 의해 밀폐된다. 이러한 상피 세포층로서 또한 외부 또는 다세포 유기​​체의 다른 구획에서 내부를 분리 장벽을 형성한다. 이러한 장벽의 주요 기능은 세포막 또는 세포 층에 걸쳐 이온의 미분 분포이다. 두 속성이 배포 허용 : 1) 막과 상피 특정 이온에 선택적 투과성을 표시; 2) 이온은 세포막 및 세포 층에 걸쳐 펌프를 통해 운반된다. 이러한 속성은 조직의 생리를 유지하는 중요한 역할을 수리하는 동안, 손상 후 신호를 신호로 작동, 또는 병적 인 상태에서. 이온 선택적 자체 참조 미세 전극은 단일 세포와 조직 수준의 칼슘, 칼륨, 나트륨 등의 이온의 특정 플럭스를 측정 할 수 있습니다. 미세 전극은 이온 운반체 칵테일을 포함특정 이온에 선택적으로 투과. 내부 도금액 관심 이온 농도 세트를 포함한다. 미세 전극의 전위는 이온의 외측 농도에 의해 결정된다. 이온 농도의 변화에​​ 따라, 미세 전극의 전위는 이온 활성의 로그 함수로서 변화시킨다. (인해 이온 플럭스 농도 구배 예) 앞뒤로 이온의 소스 또는 싱크 가까이 이동할 때 미세 전극 전위는 이온 플럭스 / 구배에 비례하는 진폭 변동한다. 증폭기는 미세 신호를 증폭하고 출력은 컴퓨터 상에 기록된다. 이온 플럭스는 그러한 특정 이온 이동성 전극 전위 변동, 미세 전극의 편위 및 다른 파라미터를 이용하여 픽의 확산 법칙에 의해 계산 될 수있다. 본 논문에서는, 우리는 이온 선택적 자체 참조 미세 전극을 사용하여 세포 외 이온 플럭스를 측정하는 방법 상세 설명몇 가지 대표적인 결과를 제시 거라고.

서론

모든 동물 세포는 외부 환경으로부터 세포질을 분리 지질 이중층 막에 의해 둘러싸여있다. 셀 이온 (1)의 능동 수송에 의해, 내부 전기 막 잠재력, 음을 유지합니다. 막 전위는 셀이 막 (2)에 다양한 분자 장치를 조작하기 위해 활용할 수있는 저장된 에너지 원이다. 뉴런과 다른 흥분성 세포는 큰 막 잠재력을 가지고있다. 나트륨 채널의 신속한 개폐는 막 전위 (탈분극)을 축소하고 신경 세포 (2)의 길이를 따라 이송되는 활동 전위를 생성한다. 이외에도 이러한 급격한 전기 변화에서, 많은 조직과 장기 생성하고 중요한 장기 전기 잠재력을 유지한다. 예를 들어, 피부 및 각막 상피 생성 및 이온의 펌핑 방향 (주로 나트륨 및 염화물) (3)에 의해 트랜스 - 상피 세포 외 전위 및 전류를 유지한다.

내인성 세포 외 전류의 측정은 진동 프로브 4-6과 세포막과 상피 세포층의 전기 파라미터의 측정을 허용 미세 전극 시스템 7-10를 사용하여 막 또는 트랜스 - 상피 전위의 측정을 사용하는 동안 십t "> 이들은 아무 수득 관련된 이온 종의 표시.

선택적 이온 운반체와 미소 전극은 용액에서 특정 이온 농도를 측정 할 수 있습니다. 이온 구배 또는 플럭스는 서로 다른 위치에 둘 이상의 전극을 이용하여 측정 될 수있다. 그러나, 각 프로브의 극한 전압 드리프트가 달라도 측정 부정확 또는 존재하지 않았다 구배에도 검출을 일으키는 것이다. 이 두 점 사이의 낮은 주파수로 이동된다 "자체 참조"모드에서 사용되는 단일 전극이 문제를 해결한다. 이제 이온 플럭스가 비교적 느린 안정된 신호 드리프트의 배경에 대해 알 수있다 (도 3b 참조).

이온 성 측정 시스템은 단일 조직 또는 세포에 가까운 작은 세포 외 이온의 플럭스를 검출하는 이온 선택성 자체 참조 미소 전극을 사용한다. 시스템은 미세 전극의 움직임을 제어하기위한 미세 전극 및 마이크로 스테퍼 모터 드라이버로부터의 신호를 처리하여 증폭기로 구성된다. 회로를 닫을 이온 선택 미세 전극 및 기준 전극은 headstage 프리 앰프 (도 1a)를 통해 증폭기에 접속된다. 컴퓨터 소프트웨어 미세 운동 (주파수, 거리)의 파라미터를 결정하고, 또한 상기 증폭기의 출력을 기록한다. 스테퍼 모터는 입체 micropositioner 통해 미세 이동을 제어한다. 이온 선택 미세 진동 저주파 1 특정 칼슘 플럭스 (11)를 측정하기 위해 1990 년에 개발되었다. 뿐만 아니라 칼슘, 상업적으로 접근 이온 운반체 칵테일 지금 MICR을 할 수 있습니다oelectrodes 나트륨, 염화 칼륨, 수소, 마그네슘, 질산 암모늄, 불화 리튬, 또는 수은 민감.

기본적으로, 자기 - 참조 이온 선택 미세 기술은 전압계에 의해 측정 될 수 전위로 용액에 용해 특정 이온의 활성을 변환한다. 이온 운반체 칵테일 혼합되지 않는 액체 이온 교환 특성 (유기, 친 유성) 단계입니다. 선택적 이온 운반체 (귀속) 특정 이온을 가역적 및 미세 전극 (전해액)에 함유 수용액 및 미세 전극을 침지시킨 수용액 (도 1d) 간의 전송들을 복합체. 이 이온 이동은 전기 화학 평형에 이르게하고 미세 전극과 기준 전극 사이의 전위의 변화는 전압계에 의해 측정된다. 전압은 네른스트 E에 따라 특정 이온 활성의 대수에 비례이온 농도 (도 2A와 B)의 계산을 허용 quation.

현재, 몇몇 시스템들은 유사한 개념 또는 원리를 이용하여 이온 플럭스의 측정을 허용한다. 예를 들어, 및 뉴만 Shabala 14-16 의해 개발 스캐닝 이온 선택 전극 기법 (SIET) (12, 13) 또는 미세 전극 이온 플럭스 추정 (MIFE) 기술이 널리 시판 특정 이온을 결정하기 위해 연구 커뮤니티에서 사용하는 동물, 식물 및 단일 생존 세포 모델에 걸쳐 다양한 세포막 및 조직에서 발생하는 플럭스. 이온 선택 미소 전극은 뇌동맥 쥐 18 꽃가루 튜브 19 스케이트 망막 세포 20 수소 유속, 마우스 뼈 (21), 각종 이온 칼슘 플럭스를 수소 칼륨 및 칼슘 플럭스 식물 뿌리 (17)에 걸쳐, 염화물 플럭스를 측정하기 위해 사용되어왔다 곰팡이 균사 (22)과 R의 플럭스단일 세포 중에 각막 창상 23, 그리고 마지막으로 칼슘 플럭스 12, 24에서 치유. 또한 이온 선택적 자체 참조 미소 전극 (25)에 대한 자세한 내용은 다음 리뷰를 참조하십시오.

다음 문서를 준비하고 단일 세포 수준에서의 이온 선택 자체 참조 미세 전극 기술을 이용 내인성 세포 외 이온 플럭스의 측정을 수행하는 방법을 상세히 설명한다.

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프로토콜

1. 이온 선택적 자체 참조 바께 미세 준비

  1. 이온 선택성 미소 전극의 제조
    1. 열은 미세 풀러를 사용하여 필라멘트 (1.5 mm 외경 1.12 mm 내경)없이 얇은 벽으로 둘러싸인 붕규산 모세 혈관을 당깁니다.
      참고 :이 팁을 직경 3-4 μm의를 제공합니다. 작은 팁 전자 노이즈에 미소 전극이 더 민감하게하고 또한 이온 농도의 변화에​​ 더 느리게 응답과 연관된 더 높은 저항을 갖는다. 유용한 정보는 스미스 외. (26)에 의해 발표 된 논문에서 찾을 수 있습니다.
    2. 친 지성 이온 운반체 칵테일의 유지를 돕기 위해 내면 소수성을 렌더링하는 전극 silanization합니다. 를 건조> 100 ℃의 오븐에서 금속 랙 및 열 O / N에 미소 전극을 배치합니다. 랙은 2mm 직경의 구멍과 금속판을 통해 방법의 일부를 천공한다. ml의 G 구멍에 전극 (250) 위쪽 팁 배치그들에 아가씨 커.
    3. 아침에, 오븐을 끄고 절연 장갑을 착용하고있는 동안, 조심스럽게 자리에 전극과 비커와 금속 선반을 제거합니다. 열을 유지하기 위해 오븐 문을 닫습니다.
    4. 라텍스 또는 니트릴 장갑, 실험실 코트와 눈 보호구를 착용 할 것. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로, 각 전극의 기지에서 실란 화 솔루션 나는 한 방울을 배치 (장소에 비커를 유지, 피펫 액세스를위한 붓는 입술을 사용한다). 실란 화 용액을 핫 플레이트에 의해 기화 전극 내부 silanizes된다. 이 단계에 대한 화학 추출기 흄 후드를 사용합니다. 몇 시간이 남아있는 실란 화 솔루션이 증발 할 수 있도록하는 뜨거운 오븐에서 랙 / 비커 / 전극을 다시 배치합니다.
      참고 : 안전을 위해, 다시 오븐을 끄지 마십시오. 이 유해 및 가연성 증기를 포함 할 수 있습니다로는에 전환 할 수 없습니다 나타내는 오븐에 레이블을 배치합니다.
    5. 냉각 후, 미세 저장 항아리 INSI에 미소 전극을 저장400g의 건조제와 유리 데시 드. 미소 전극 많은 주 동안 이렇게 저장할 수 있습니다.
      참고 : 다른 실란 화 방법은 스미스 등에 설명되어 있습니다 (26).
    6. 측정 될 100mM의 이온을 함유하는 용액을 50 내지 100 μL (약 1cm의 길이) (표 1 및도 1b)로 미세 전극을 백 채운다. 미세 필라멘트에 분젠 버너에서 뽑아 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫의 열을 사용합니다. 막힘을 방지하기 위해 이후 DH 2 O의 피펫을 씻어.
      주 : 대안 적으로, 외부 용액 (27)의 이온 농도에 맞게 백필 용액의 이온 농도를 조절한다.
    7. 기포의 유무를 확인하기 위해 해부 현미경 하에서 미세 전극을 관찰한다.
      1. 수직으로 전극을 누른 상태에서 거품이 손톱으로 가볍게 미세 현재 탭 경우 (아래 팁) 및 / 또는 거품을 밀어바늘을 교체 실리콘 튜브 변성 주사기를 사용하여 배압을인가함으로써 팁을이야.
    8. 이온 특정 이온 운반체 칵테일 15-20 NL (30-50 ㎛의 길이)로 미세 전극 팁을 채우기 (표 1 참조). 현미경 슬라이드의 짧은 가장자리에 이온 운반체 칵테일의 작은 방울을 배치합니다. 해부 현미경 하에서 미세 팁을 관찰하고 미세 팁이 약 절반 초 동안 이온 운반체 칵테일에 닿을 때까지 현미경 슬라이드를 향해 이동합니다. 모세관 압력에 의해 미세 전극에 이온 운반체 칵테일을 그립니다.
      참고 :이 전자 간섭 (노이즈)에이 취약 할 수 프로브의 전기 저항을 증가시키고 또한 응답 시간을 둔화 이온 운반체 칵테일의 긴 열을 피하십시오.
    9. 금 1mm 남성 커넥터와 AgCl을은 (Ag +) 선 (그림 1B)와 직선 미세 홀더에 미세 전극을 마운트합니다.
    10. 입체 컴퓨터 제어 전자 micropositioner (그림 1A)에 장착 된 헤드 단계로 미세 전극 홀더를 연결합니다.
    11. 샘플이 측정 될 때까지 용액을 측정하기에 적합한 미세 전극 팁을 배치 (생리 식염수는, 배양액 등) 미세 전극은 HR 또는 둘, 또는 밤새 안정 될 수 있도록.
  2. 기준 전극의 제조
    1. 기준 전극 (도 1C)는 상기와 동일한 모세관이다. 5cm 길이로 다이아몬드 연필로 모세관을 잘라 분젠 화염에 1-2 초 동안 각 끝 부분에 불이 연마.
    2. 염화나트륨의 3 M 용액 ~ 200 μL와 이들 전극 채우기 2 % 아가 로스 CH 3 CO 2 K (칼륨 아세테이트) 또는 KCl을. 이온 액에 따라 측정 할 선택 (기준 전극은 측정되는 이온을 함유하지 않아야 표 1 참조). 혼합아가로 오스 거의 전자 레인지에 끓는에 대한 해결책 및 열. 아가 로스를 교반하여 용해 (용액은 맑은 간다).
    3. 플라스틱 파스퇴르 피펫에 기준 전극을 부착하고 모세 혈관에 뜨거운 용액을 그립니다.
    4. 사용하기 전에 밀봉 된 관이 3 M 용액에 찬 3 M의 NaCl, CH 3 CO 2 K 또는 KCl을 솔루션 및 저장소에 전극을 삭제합니다. 공기 방울 어떤 기준 전극을 폐기하십시오.
    5. 직선 미세 전극 홀더 기준 전극 내부 (프리 필드 3 M 용액으로) AgCl을은 (Ag +)과 펠렛과 금 2mm 남성 커넥터 (그림 1C)를 장착하고 수동 마이크로 포지셔너에 전극 홀더를 부착 자기 스탠드에 장착.

2. 이온 선택적 자체 참조 바께 미세 교정

  1. 상기 기준 용액과 관심 이온을 함유하는 용액을 교정 준비하는 단계; 표 1 참조 옹. 솔루션 샘플이 될 것이다 (예를 들어 문화 미디어, 생리 식염수)에 농도를 브래킷. 즉, 하나의 교정 액을 상기 측정 용액에 비해 이온의 낮은 농도를 포함하는, 하나 이상 있어야한다.
    1. 예를 들어, K + 1 mm의 포함 식염수를 사용합니다. 이 농도를 브래킷에, 연속 희석 10, 1 및 0.1 mM의 농도로 탈 이온수에서의 KCl 분말을 용해. 이러한 교정 솔루션을 사용합니다. 대안 적으로, 이러한 솔루션들 중 적어도 두 개를 사용한다.
  2. 이온 선택 미세 각 보정 용액에 기준 전극을 담그고 전압 값이 전용 소프트웨어를 사용하여 전압을 기록하기 전에 1 분 내지 3에 대해 안정되도록 (표 1 참조).
  3. 소프트웨어 TXT 파일 등 데이터 (증폭기 출력)로서 저장, 스프레드 시트 파일로 데이터를 복사한다. 의 대수에 대해 미세 출력 (MV)을 플롯몰 이온 농도 (도 2A).
  4. 선형 회귀를 적용하고 네른스트의 기울기, 절편 및 R 2 값을 계산합니다. 네른스트 슬로프 가의 이온이 58 ± 11 MV / 10 년 2 가의 이온이 29 ± 11 MV / 10 년이면 미세 전극을 그대로 (양이온, 네른스트 슬로프 음이온이 음수, 양수). 또한, 좋은 미소 전극 강한 선형 상관 관계 (도 2B R 2> 0.9)이 있어야합니다.
    참고 : 여기에 사용되는 증폭기의 MV 출력 (MV)이 10 배 증가와 함께 읽고 있습니다. 값은 10의 계수로 나눌 수있다.
  5. 실제 이온 농도 (그림 2B)로 미세 전극의 원시 MV 출력을 변환하는 선형 회귀 공식을 사용합니다.

이온 선택 미세 전극 기법 3. 검증

  1. 인공 소스를 준비
    1. 인공 소스 모세 혈관 같은 모세 혈관과 같다위. 열 단계 1.1.1에서와 같이 미세 풀러를 사용하여 모세관을 당깁니다.
    2. 염화나트륨,의 KCl 1 M 용액 200 μL, CaCl2를 H 2 O 2 또는 4의 pH 완충액이 모세관 백필. 선택에 따라, 이온 소스 인공 용액 (표 1 참조)을 측정한다.
      참고 : 또는 더 큰 팁 직경 (~ 20 μm의)와 함께 전극을 끌어 동일한 솔루션 팁을 작성하지만, 0.5 % 아가로 오스를 포함 (아가로 오스 솔루션의 대량 흐름을 방지 할 수 있습니다).
    3. 미세 조작기에 인공광 모​​세관 마운트 시료에서의 이온 플럭스를 측정하기 위해 사용되는 용액에 담궈. 구배의 안정화를 허용하도록 1 시간 30 분 동안 용액에 인공광 남기기.
  2. 이온 선택성 미소 전극의 검증
    1. measu하는데 사용 용액 인공광 모​​세관으로부터 약 일cm 떨어진 이온 선택 미세 전극을 담그고샘플에서의 이온 플럭스 Re 및 이전과 기준 전극으로 회로를 닫는다. 전압 값은 1 내지 2 분 동안 전용 소프트웨어를 사용하여 전압을 기록하기 전에 1 분 내지 3에 대해 안정되도록. 이 값은 (또한 참조, 배경 또는 빈 값으로 참조 문헌에) 버퍼 값에 해당합니다.
    2. 인공 광원으로부터 약 5 ㎛, 이온 선택 미세 전극을 이동시키고 1 내지 2 분 동안 소프트웨어를 사용하여 전압을 기록하기 전에 전압 값이 1 분 내지 3에 대해 안정되도록.
    3. 인공 소스 모세관으로부터 멀리 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 및 1280 μm의 이온 선택성에 미세 전극을 배치하여 상기 절차를 반복한다.
    4. txt 파일 등의 데이터를 추출하고 스프레드 시트 파일로 값을 복사합니다.
  3. 캘리브레이션 값과 동일한 방식으로 MV 값에 대응하는 이온의 농도를 계산한다. 값을 플롯.
    아니TE : 이온 플럭스가 존재하는 경우, 미세 전극이 두 위치 (도 3b) 사이의 이온 농도의 차이를 검출한다. 인공 소스 용액보다 측정 종 이상의 이온을 포함하는 경우, 농도가 제대로 (이 경우 이온 플럭스의 방향을 검출하는 이온 선택성 미세 전극의 기능을 검증 멀리보다 소스에 더 가까워 야 유출, 인공 싱크, 매체를 측정보다 낮은 특정 이온 농도, 그것은) 유입되어야한다.
    1. 픽 (Fick)의 확산 법칙을 이용하여 이온 플럭스를 계산 : J = C μ C는 용액 중의 이온 농도 (몰 cm -3)이며, μ 이온 이동도를이다 (DC / DX) (몰 cm의 N -1 초 -1) , 및 직류 거리 DX (cm) (도 2c)을 통해 농도 차이이다. 이온 플럭스 데이터는 대개 pmol의 cm -2 (S)로 표시되는-1 또는 nmol의 센티미터 -2 초 -1.
      주 :.. 스미스 등 26에 의해 설명 이온 플럭스 계산의 다른 방법이 사용될 수있다. 주요 차이점은 확산 계수의 사용 대신에, 이온의 이동성과 샘플없이 식염수에서 이온 플럭스의 측정으로부터 계산 된 배경 이온 플럭스 (또한 드리프트 또는 보정 팩터 전압)의 감산을 포함한다.
    2. 소스 (도 2D)로부터의 거리에 대해 각 단계의 이온 플럭스의 평균 플롯. 광원으로부터 멀리 이동하는 이온 플럭스의 다른 크기를 감지 이온 선택 미세 전극의 기능을 검증하는 자속 값의 지수 감소를 관찰한다.
    3. 큰 신호 대 N으로 올바른 방향 및 크기 측정 값의 유효성을 검증하기 위해 기록되는 것은 각각의 특정 이온에 대해 한 번 인공광 유효성 검사를 수행하여OISE 비율.
      참고 : 시료없이 완충액의 이온 플럭스 측정 백그라운드 레벨 또는 잡음을 나타낸다. 일반적으로, 버퍼 측정 변수의 방향을 표시합니다 아주 작은 플럭스로 이어지는 이온 농도의 뚜렷한 변동을 보여줍니다.

상공 회의소 측정 4. 준비

주 : 실험 전에 샘플을 측정 할 것을 고려하고 샘플이 얼마나 장착 미세 측정에 고정화된다.

  1. Xenopus의 난자는 측정이 800 μm의 나일론 메쉬 (nitex 메쉬)의 1cm 사각형을 잘라 플라스틱 페트리 접시 (그림 1E)로 접착제 laevis의하십시오.

5. 이온 플럭스 측정

  1. 보정 용액과 동일한 방법으로 샘플을 측정을 수행하기 위해 사용되는 버퍼에 존재하는 이온의 농도를 측정한다. X. laevis의 난자는 마크의 수정 된 벨소리 (MMR)이 필요합니다. 디100의 NaCl, 2의 KCl, 2 염화칼슘은, 하나의 MgCl 5 HEPES : issolve의 NaCl, KCl을, 염화칼슘, 및 탈 이온수의 MgCl로는 HEPES (MM)의 최종 농도에 도달한다. NaOH를 사용하여 7.5로 버퍼의 pH를 조정합니다.
  2. 측정 챔버에 샘플을 놓고 미세 전극 (도 3a)의 근접 위치를 정의하는 micropositioner 사용 (약 10 μm의 거리)에 가까운 샘플 이온 선택 미세 전극을 가지고.
  3. 전용 소프트웨어를 사용하여 가까운 위치와 거리 (먼) 샘플에서 위치 사이의 미세 전극의 낮은 주파수 (0.3 Hz에서) 여행 (100 ㎛)를 시작합니다. 미세 전극의 이동은 시료의 표면에 수직 인 것으로 확인.
    참고 : 미세 전극의 여행이 소프트웨어를 설정할 수 있습니다. 대형 여행은 측정 동안 동안 작은 플럭스 쉽게 검출 가능 판독 구배 샘플링 간격을 길게하고 시간 해상도를 감소 증가시킨다. 참조 예를 들어 그림 3A.
  4. 소프트웨어를 이용하여 기록을 시작한다. 미세 전극은 각각의 위치에서 일시 정지 MV에 전위를 컴퓨터 상에 기록된다. 신호의 안정화를 허용, 최소 2 분 동안 측정을 얻습니다. 짧은 시간 경과 실험, 전체 시간 경과에 대한 관심의 위치에서 기록 잠재적 인 변화를.
  5. txt 파일 등의 데이터를 추출하고 스프레드 시트 파일로 값을 복사합니다.
  6. 캘리브레이션 값과 동일한 방식으로 MV 값에 대응하는 이온의 농도를 계산한다. 값을 플롯.
    주 : 이온 플럭스가 존재하는 경우, 미세 전극이 두 위치 (도 3b) 사이의 이온 농도의 차이를 검출한다.
  7. (단계 3.3.1) 이전처럼 확산 픽의 법칙을 이용하여 이온 플럭스를 계산한다.
  8. 새로운 샘플을 측정하기 전에 버퍼 측정을 반복하고 모든 새를 위해 플럭스 측정 및 계산의 절차를 반복샘플.

6. 통계 분석 및 데이터 프레 젠 테이션

  1. 및 / 또는 혼합 효과 28 ANCOVA 모델을 이용하여 상기 제어 조건 하에서 이온 플럭스에 시간의 위치의 영향을 독립적으로 테스트한다.
    주 : 공분산 분석 (ANCOVA)은 두 범주 연속 대책 독립 변수로서 이용 될 수 있도록하여 일반 ANOVA 및 회귀 혼합 일반 선형 모델이다. 또한, 개인 및 최종 중첩 효과 당 반복 측정에 의한 상관 된 오류의 존재하에 혼합 효과 모델은 모두 고정 랜덤 효과 정확한 추정치를 모델링하는데 사용된다.
  2. 여러 테스트를 28 페로 니 보정과 그룹 레벨 사이의 학생 T의 -test를 사용하여 쌍으로 비교를 계산합니다.
  3. 박스 플롯은 위치와 시간에 따라 이온 플럭스 측정을 요약하기 위해 생성한다. 기술 페어 학생 T에서 P 값을 포함(도 3d) 다음과 같이 상기 P 값의 유의 수준을 나타낸다 : * : p <0.05; ** : P <0.01; *** : P <0.001 (29)

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결과

우리는 이전에 칼슘 유입이 하나의 셀 (24) 부상 후 나타나는 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 다른 이온 플럭스는 단일 세포 상처에 발생 여부를 물었다. 우리는 X를 사용 난자, 단일 셀 상처 치유 30-34과 전기 생리 기록 24,35-39에 대한 잘 확립 된 모델을 laevis의. 흥미롭게도, 칼륨 이온은 X. 내부 더 농축하여 laevis의 것은 난자 (약 110 mM)을 (MMR 1 배에서 1 mM)을 사용하는 세포 외 용액에서 40 상처에 따라 칼륨의 유출을 시사한다. 상기 가정을 확인하기 위해, 우리는 X. 과정 중에 칼륨 플럭스를 측정 이온 선택 자체 참조 미세 전극을 이용하여 난자 세포막 laevis의 치유.

난자 상처하려면 먼저 큰 팁 크기 (~ 50 μm의)와 모세관 전극을 당깁니...

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토론

생체 내에서 세포 외 이온 플럭스의 성공적인 측정을위한 가장 중요한 단계는 : 소음의 감소, 이온 선택성 미소 전극과 기준 전극의 정확한 제조 한 샘플과 두 전극의 위치.

잡음을 최소화하기 위해, 기록 방식이 바람직 또한 접지되어 금속 얹어 (제진) 테이블과 접지 된 패러데이에 있어야한다. 또한, 현미경 섀시는 또한 접지되어야한다. 전기 노이즈의 소스는 광원을 포함한다. 광섬유 '팬이없는'광원은 최소한의 전기적인 노이즈가 발생합니다. 마지막으로, 소유자는 염화물 미세에 실버 와이어와 펠렛을 유지하는 (차아 염소산 나트륨 표백제에 딥과 DH 2 O에 린스)를 사용하여 소음을 최소화 이온 선택적 미세 또는 측정 될 것이다 기준 전극에 공기 방울의 국지적 인 존재 같은 실패미세 전극의 전도성은 존재하지 않거나 손상 될 것입니다. 따라서, 홀더에 장착하기 전에이를 현미경으로 전극을 확인하는 것이 중요하다. 공기 방울을 제거하기위한 세...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 National Science Foundation 보조금 MCB-0951199, NIH 보조금 EY01910, California Institute of Regenerative Medicine 보조금 RB1-01417 및 Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) 보조금 SFRH/BD/87256/2012의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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아이오앰프   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA미국매사추세츠주 우즈 홀에 있는 BioCurrents Research Center에서 만든 증폭기 없음; 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 해당 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USABioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA에서 만든 소프트웨어 없음; 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 해당 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/)
헤드 스테이지 프리 앰프  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAINA116BSR 전압 팔로워 INA116, BioCurrents Research Center에서 설계, Woods Hole, MA, USA; 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 해당 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep 드라이버  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAX, Y 및 Z 포지셔닝에는 3개의 MicroStep 드라이버가 필요하지 않습니다. BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA에서 제작했습니다. 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 적용 가능한 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/)
수동 마이크로 포지셔너   세계 정밀 기기 모델 KITE-R유사한 시스템은 적용 가능한 전자제품(http://www.applicableelectronics.com/)마그네틱 스탠드에서 구매할 수 있습니다
     World Precision Instruments모델 M10유사한 시스템은 Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)진동 절연 표에서 구입할 수 있습니다
.   뉴포트 Inc.         모델 VW-3036-OPT-023040유사한 시스템은 적용 가능한 전자제품(http://www.applicableelectronics.com/)에서 구매할 수 있습니다.
가지 차원의 마이크로포지셔너의 일부입니다: 꺾쇠 괄호, 90도;, 슬롯형 면Newport Inc.         모델 360-90세 개의 dimantionnal micropositionner의 집합체는 또한 X, Y, Z 제어를 위한 세 개의 전기 회전 모터, MCA-2 조절 가능한 각도 포스트가 있는 MPH-1 마운팅 암, 그리고 다양한 Newport 커넥터와 진동 테이블에 볼트로 고정하는 나사가 필요합니다
세 가지 차원의 micropositioner의 일부: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X TravelNewport Inc.         460PD-X없음
3차원 마이크로포지셔너의 일부: 퀵 마운트 리니어 스테이지, 0.5인치 XY TravelNewport Inc.460A-XY없음
Kwik-Fil 필라멘트가 없는 얇은 벽의 붕규산 유리 모세혈관 세계 정밀 기기 TW150-4없음
전극 풀러 나리시게  PC-10없음
금속 랙자체 제작없음금속 전극 홀더는 10cm x 15cm 크기의 강철 바닥에 반 센티미터 간격으로 2mm 너비의 구멍을 드릴링하여 집에서 제작
QL모델 10 랩 오븐없음
실란화 솔루션 I Sigma-Aldrich85126위험, 제공자가 권장하는 대로 처리 
유리 페트리 접시; PyrexFisher Scientific316060없음
전극/마이크로피펫 저장 항아리World Precision Instruments E215없음
유리 건조제Fisher Scientific08-595E에는 드라이라이트 건조제(WA Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA)가 포함되어 있습니다. 밀봉에 바셀린을 올려 밀폐시킵니다.
플라스틱 파스퇴르 피펫 Fisher Scientific11597722없음
Bunsen 버너Fisher ScientificS97329없음
현미경 슬라이드Sigma-AldrichS8902없음
직선 미세전극 홀더Warner InstrumentsQSW-A15P는 금색 1 mm 남성 커넥터와 Ag/AgCl 와이어가 있습니다
. 직선형 미세전극 홀더 AgCl(Ag+) 펠릿이 내부에 있고 금색 2 mm 남성 커넥터가 있는World Precision InstrumentsMEH3S
6cm 페트리 접시VWR60872-306없음
Nitex 메쉬Dynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750접착제 없음
; 록타이트 에폭시VWR500043-451플라스틱 계량 보트에 접착제와 경화제를 같은 비율로 혼합하고 철저히 혼합합니다. 빨리 설정되지만 완전 경화를 위해 24시간 동안 RT로 두십시오
. 탈이온수 시그마-알드리치99053없음
염화나트륨시그마-알드리치S7653없음
염화칼시그마-알드리치P9333없음
염화칼슘시그마-알드리치C1016없음
염화마그네슘시그마-알드리치M8266없음
헤페스시그마-알드리치H3375없음
수산화 나트륨: 시그마 -알드리치S8045없음
, 칼륨 아세테이: 시그마 - 알드리치P1190:
아가 로즈시그마 - 알드리치A9539없음
세 . ;륨 트

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