방법 논문

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출 현장에서 하이브리드

DOI:

10.3791/52799

⸱

2015년 6월 17일

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

이 논문에서

요약

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RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

초록

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mRNA를 자주 척추 축삭에 지역화 및 로컬 번역 축삭 길 찾기 또는 개발 과정과 postdevelopmental 기간에 유지 보수, 수리 또는 신경 퇴행에 대한 분기가 필요합니다. 높은 처리량 분석은 최근 축색 돌기 이전에 예상했던 것보다 더 역동적이고 복잡한 사체을 가지고 계시했다. 이러한 분석은, 그러나 대부분의 축삭이 somato-수지상 구획에서 고립 될 수있다 배양 신경 세포에서 수행되었다. 이는 생체 내 전체 조직의 이러한 격리를 달성하는 것은 사실상 불가능하다. 따라서, 전체 동물에서의 mRNA 및 기능적 관련성의 채용을 검증하기 위해, 전 사체 분석은 이상적 동일계에서의 mRNA의 시각화를 허용 기법과 결합되어야한다. 최근에, 단일 분자 수준에서의 RNA를 검출 ISH 신규 기술이 개발되었다. mRNA는 세포 내 위치 파악을 분석 할 때 특히 중요이후 지역화의 RNA는 일반적으로 낮은 수준에서 찾을 수 있습니다. 여기에서 우리는 새로운 고감도 RNA ISH 기술을 사용하여 axonally 지역화의 mRNA의 검출을위한 두 개의 프로토콜을 설명합니다. 우리는 성숙 마우스와 인간의 두뇌의 생체 내에서 축삭에 ATF4의 mRNA의 채용을 확인하기 위해 형광 면역 조직 또는 조직 학적 염료를 사용하여 축삭 Counterstain과 함께 RNAscope ISH를 결합했다.

서론

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축삭 mRNA의 모집 및 지방 번역은 시간적으로 공간적으로 급성으로 1 세포 외 자극에 반응하는 축삭 수 있습니다. 인트라 축삭 단백질 합성은 가장 엑손 9-11과 길 찾기를 역행 12,13 시그널링이 성장 원추 동작 2-8에서 결정적인 역할을 신경 발달의 맥락에서 이해된다. 축삭 mRNA와 리보솜 수준이 크게 14,15 감소하지만 훨씬 적은 포스트 발달 신경 축삭에서 단백질 합성의 기능적 중요성에 대해 공지되어있다. 성숙한 척추 축삭이 긴 16 병진 비활성 것으로 생각되고있다. 그러나 최근의 연구는 지역의 번역이 병적 인 상태에서 성숙 축삭에서 활성화되어 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 서브 세트의 mRNA가 신경 손상과 인트라 축삭 단백질 합성은 이들 축색 돌기 (17)의 정확한 재생을 위해 요구되는 다음 재생 축삭을 모집한다. 또한, 우리 그룹의 하S는 알츠하이머 병 펩타이드 Aβ 1-42, 그리고 전사 인자 ATF4의 지역 번역 로컬 노출이 신경 소마 (18)에 축삭에서 Aβ 1-42의 신경 퇴행성 효과를 전파하는 데 필요한 후 특정의 mRNA가 축색 돌기에 채용되는 것을 보여 주었다. 마지막으로, 높은 처....

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프로토콜

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모든 동물의 절차는 컬럼비아 대학의 IACUC 및 관리 및 실험 동물의 사용을위한 관련 규정에 의해 승인 된이 추적 관찰 하였다. 참고 :의 RNase-무료 또는 DEPC 처리 된 물에 ISH 절차에 사용되는 모든 버퍼를 준비합니다. ISH가 완료된 있지만 버퍼가 여전히 멸균 된 두 번 증류수 제조 및 / 또는 필터링에 의해 살균하는 것이 좋습니다 후이 권장 사항은 엄격하게 할 필요가 없습니다.

1. 면역에 의해 이어 원위치 하이브리드 화에서 성인 마우스 뇌 사용하여 형광의 콜린성 축삭에 ATF4 mRNA의 현지화 (물고기)의 검출

  1. 파라 포름 알데히드 고정 냉동 뇌 조각의 샘플 준비
    1. 다음과 같은 예를 들어, 고정 냉동 마우스 뇌에서 조각을 준비합니다.
      1. 간단히, 케타민으로 마취에 의해 9개월 된 쥐를 희생 (100 mg을 kg -1 체중)과 자일 라진 (10 mg을 kg -1 몸 weigHT) PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 transcardial 주입 (PH 7.4) 하였다.
      2. 4 O ℃에서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌 및 사후 수정을 제거....

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결과

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상술 한 절차의 간단한 요약이도 1에 도시된다.

ATF4 mRNA의 최적의 검출은 열 유도에 마스크를 사용하여 콜린성 축삭의 과립

지역화 된 mRNA의 축삭을 평가할 때, 축삭을 식별 할 수 있어야하고, 낮은 풍부한 RNA를 시각화 할 수있는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 RNA ISH 기술은 단일 분자 분해능의 RNA를 검출 할 수있다. 이 기술을 사용하는 표준 프로토콜을 효율적으로 표적 RNA를 검출하기 위해 두 개의 마스크를 제거하는 절차의 조합을 제안한다 : 프로테아제 - 유도 및 언 마스킹 (28)을 열 유도. ISH는 축삭을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색과 결합 될 때 그러나, 단백질 분해 효소에 의한 마스크 해제 최적의 항원 검출 (29)가 발생하지 않을 수 있습니다.

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토론

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이보고에서는 axonally 지역화 ATF4 mRNA를 검출 고해상도 ISH 기술의 사용을 설명한다. 이 이전 발표 된 연구는이 기술이 조직 또는 전체 배아 (33)에 항체 기반의 단백질 검출과 호환되는지 보여준다. 중요한 것은 최근 해마 뉴런의 수상 돌기 (34) 내의 아크의 mRNA의 검출을 위해 사용되었다. 또한, 조직 학적 염색 용 염료와 조합 될 수있다. 마지막으로, 다수의 RNA를 대상 28,30,33의 동시 검출을 위해 적합하다. 이러한 결과는 고해상도 RNA ISH 기술의 기능성을 예시하고, 원래의 프로토콜을 약간 변형이 이러한 방법의 민감도를 감소시키지 않는다.

단일 분자 분해능 조직에서 관심의 mRNA를 검출하기위한 Z-구조 프로브의 사용을 기술하는 원래 프로토콜 mRNA를 포함하는 마스크 제거 단계를 두 건의프로테아제 소화 샘플 30,35 끓는. .......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 알츠하이머 협회(NIRG-10-171721, U.H.), 국립 정신 건강 연구소(MH096702, U.H.), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(NS081333, C.M.T.)의 지원을 받았으며, 뉴욕 뇌 은행을 지원하는 컬럼비아 대학의 국립 노화 연구소(National Institute on Aging-funded Alzheimer's Disease Research Center, AG008702, J.B. 및 Y.Y.J.)의 파일럿 연구 상도 지원받았습니다. 의견과 토론에 대해 Hengst 연구소 구성원에게 감사드립니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마우스 Atf4 mRNA의 잔류 물 20-1,381을 표적으로 하는 맞춤형 프로브(NM_009716)고급 세포 진단-인간
ATF4 mRNA의 잔류 물 15-1,256을 대상으로 하는 맞춤형 프로브(NM_001675.2)고급 세포 진단-프로브
음성 대조 프로브-DapB고급 세포 진단310043프로브
양성 대조군 프로브-마우스 Polr2A(옵션)고급 세포 진단312471프로브
양성 대조 프로브-인간 PPIB(옵션)고급 세포 진단313901프로브
RNAscope 형광 다중 시약 키트(형광 검출용)고급 세포 진단320850현장 혼성화 키트
RNAscope 2.0 HD 시약 키트 - BROWN (발색 검출용)Advanced Cell Diagnostics310035in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibodyMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain KitAmerican MasterTechKTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute)American MasterTechCACLEGAL
ProLong Gold 마운팅  DAPILife TechnologiesP36935
DPX 마운팅 미디엄Sigma6522
가 있는 매체

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. ....

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재인쇄 및 허가

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In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

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