Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

Summary

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Abstract

수용체의 세포 내 이동은 복잡하고 고도로 통제된 과정의 집합체입니다. 수용체 이동은 리간드에 대한 신호 전달 및 전반적인 세포 반응성을 조절하며, 그 자체로 리간드 유도 신호전달을 포함한 세포 내 및 세포 외 조건의 영향을 받습니다. 단층 도금 배양 세포와 함께 사용하도록 최적화되었지만 자유 부유 조직 절편으로 확장할 수 있는 이 프로토콜은 면역 라벨링 및 공동 국소화 분석을 사용하여 외인성 약물 치료를 포함한 만성/장기 및 급성 중재 후 세포 내 수용체 이동의 변화를 추적합니다. 약물 처리 후, 세포는 수용체(receptor)와 관심 세포 내 구획(intracellular compartment)에 대한 마커를 위해 이중 면역 표지됩니다. 그런 다음 순차 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 세포의 2채널 현미경 사진을 캡처하고, 이는 컴퓨터화된 공동 국소화 분석을 거쳐 정량적 공동 국소화 점수를 산출합니다. 이러한 점수는 통계 분석 전에 독립적인 반복실험을 풀링할 수 있도록 정규화됩니다. 대표적인 현미경 사진도 처리하여 예시적인 그림을 생성할 수 있습니다. 여기에서는 유도된 수용체 이동을 정량적으로 평가하기 위한 강력하고 유연한 기술에 대해 설명합니다.

Introduction

수용체 특히, G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는, 정기적으로 및 세포 표면 ^{(1)로부터,} 세포 내에서 팔려. 이 복잡하게 조율하고 엄격하게 제어 과정은 세포의 가능한 수용체 보완을 지시하고 수용체 시간 활동, 탈감작 및 resensitization ² 조절 ^{- 4.} 중요한 것은, 이들 방법은 약물 유발 수용체 활성 또는 비활성을 포함한 셀룰러 환경에 응답한다. 즉, 수용체에 리간드의 행동함으로써 세포 응답을 변경, 그 수용체의 세포 내 인신 매매를 변경할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 외부 리간드에도 고전 메신저 투 이펙터 캐스케이드 ^5,6- 넘어 더 효과 세포 기능에 아직 발휘.

유도 수용체 인신 매매에 이러한 변화를 검토하는 것은 어렵다. 사용 가능한 모든 기술은 한계를 포함한다. 비오틴 보호 분석법 모니하는데 사용되어왔다토르 표면 수용체 집단. 이들 수용체는 바이오틴 화되어 면역 침전의 timecourse은 시간이 지남에 따라 바이오틴 수용체의 감소를 정량화하기 위해 수행된다. 이러한 기술은 본질적으로 수용체 ^(7)의 초기 레이블, 인구의 점진적인 열화를 모니터링하고,이 공정의 시간 코스를 구성하는데 매우 유용하다. 불행하게도,이....

Protocol

참고 :이 프로토콜은 다양한 단층 도금 세포 / 조직 문화 모델, 약물 치료 요법, 및 라벨 대상으로 광범위하게 호환됩니다. 따라서 실제 사용에서, 많은 특정 매개 변수는 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에, 이러한 사용자 정의 매개 변수에 대한 참조는 일반적인 있습니다. 대표적인 결과를 얻기 위해 사용되는 예 조건은, 이탤릭체에 포함되어 있습니다.

1. 솔루션

1. 0.1 M 트리스 버퍼 고장 성 (300 mM)을 식염수와 0.05 % 폴리 솔 베이트 20을 혼합하여 세척 버퍼를 준비; 실온에서 pH가 7.4.
2. 버퍼를 차단 준비합니다. 0.05 M 트리스 버퍼 고장 성까지 (300 mM)을 식염수는 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 0.1 % 차가운 물고기 피부 젤라틴을 추가하고 실온에서 7.4로 pH를 조정합니다.
3. 0.05 M 트리스 - 완충 고장 성 (300 mM)을 식염수로 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 1 % BSA, 0.1 % 냉 물고기 껍질 젤라틴을 첨가하여 항체 희석액을 준비하고 4 ^O ℃에서 7.4로 pH를 조정
   참고 : 트리스 버퍼의 pH는 온도에 따라 달라집니다. 즉, 온도 변화는 용액....

Results

이 기술을 사용하면, 장기간 / 만성 및 급성 약물 치료 모두 다음 수용체 내재화 후 거래의 변화를 정량화하는 것이 가능하다. 약물 치료, 정착, 및 표지 한 후, 고해상도 2 채널 현미경은 관심의 각 셀의 포획된다. 대표적인 이미지는 예시적인 도면 (도 1)를 생성하기 위해 거짓 색 colocalization을 함께 결합 될 수있다. 후속 colocalizational 분석 한 바와 같이, 목표 대상 colocalization을 (예를 들어, 수용체 - 구획 마커)의 정량적 점수를 얻었다. 이 데이터는 그 다음,이 경우, 변화에 비교하기 위해 사용될 수있다, 약물 치료 (S) (도 2)에 의해 유도 된 수용체 매매.

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Discussion

우리는 성인 후근 신경절 신경 세포 (차 감각 뉴런)의 차 문화의 분석을 위해이 프로토콜을 최적화했다. 또한 광범위 단층 도금 배양 된 세포에 대해 거의 또는 수정없이 사용할 수있다. colocalizational 분석 그러나 약물 치료 및 조직 고정 / 혼합물의 구성 요소가 적절하지 않을 것입니다, 또한 조직의 조각 및 기타 준비 ^(11)에서 가능하다.

흥미로운 것은, 여기에 제시된 ICC 방법은 또한, 조직 슬라이스의 이중 면역 표지를 수행 할 적절한 정착 및 티슈 제조에 사용될 수에 관계없이 후속 분석 (예를 들어, ^19).

이 프로토콜은 서로 다른 라벨 대상으로 광범위하게 호환됩니다. 도금 세포의 각 coverslip에 두 번 표시됩니다. 전형적으로, 이것은 관심 수용체 관심 구획 중 하나의 마커에 대한 것이다. 그곳에일반적으로 다수의 다른 구획 수용체 coloc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	: 시그마 Aldrich	T1503-500G
염화나트륨	: 시그마 Aldrich	S9888-500G
트윈 20	Fisher Scientific	BP337-500
염산	Aldrich	258148
알부민	시그마 Aldrich	A7906-100G
냉수 어류의 젤라틴 스킨	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar 세포 배양 플레이트: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 서클 현미경 커버 유리	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
인산나트륨 일염기성	시그마 Aldrich	S9638-500G
나트륨 인산염 이염기성	시그마 Aldrich	S9763-500G
파라포름알데히드	Polysciences	00380-1
Dumont #5 집게 - 표준/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
토끼 항-DOR 항체	MyBioSource	MBS316175	1:1,500에 사용
항-Rab5 항체	Sigma Aldrich	R7904	1:750에 사용
마우스 anti-Rab11 항체	Millipore	05-853	1:500
염소 anti-LAMP1 항체	Santa Cruz	SC8098	1:750
당나귀 안티 토끼 Alexa 488 접합 항체	Life Technologies	A-21206	1:200 to 1:2,000
염소 안티 마우스 Alexa 594 복합 항체	Life Technologies	A-11005	1:200 to 1:2,000 사용
당나귀 안티 염소 Alexa 594 접합 항체	Life Technologies	A-11058	1:200에서 1:2,000에 사용