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방법 논문

반응성 신경교 증 트리거링

10.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52825

⸱

2015년 6월 29일

 , 
1Department of Biology, Drexel University

이 논문에서

요약

이 기사는 성체 쥐에서 전뇌 찌르기 부상을 일으키는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 칼에 찔린 부상은 심각한 반응성 신경교증과 신경교세포 반흔 형성을 유발하며, 이는 나중에 표준 면역조직화학법으로 검사할 수 있습니다.

초록

중추신경계에 손상을 입은 후, 성상세포는 반응성 성상교세포증(reactive astrogliosis)이라고 통칭되는 광범위한 생화학적, 형태학적, 분자적 변화를 겪습니다. 반응성 성상세포는 각각 신경 복구를 억제하고 촉진하는 염증 효과와 보호 효과를 모두 발휘합니다. 반응성 성상교세포증의 다양한 기능적 특성의 기저에 있는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 달성하는 것은 손상된 CNS를 치료하기 위한 치료 전략을 개발하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 전뇌 찌르기 병변을 사용하여 성인 마우스 전뇌에서 반응성 성상교세포증을 유발하는 방법을 보여줍니다. 이 병변 모델은 간단하고 신뢰할 수 있으며 입체 장치와 메스 날만 있으면 부상을 입힐 수 있습니다. 칼에 찔린 병변을 전뇌의 손상 모델로 사용하는 것은 잘 확립되어 있으며 신경 변성, 신경 염증 및 혈액 뇌 장벽(BBB)의 파괴와 같은 광범위한 신경 병리학적 결과를 다루는 연구에 적용할 수 있습니다. 따라서 전뇌 찌르기 손상 모델은 외상에 대한 중추신경계 반응에 대한 광범위한 연구에 적용할 수 있는 강력한 도구 역할을 합니다.

서론

손상된 중추신경계를 치료하기 위한 성공적인 치료법을 개발하기 위한 주요 과제는 외상에 의해 유발되는 복잡한 다세포 사건에 대한 불완전한 이해입니다. 반응성 성상세포는 새로운 치료법의 유망한 표적으로 점점 더 인식되고 있습니다1. 역사적으로 신경 복구에 적대적인 것으로 간주되었지만, 반응성 성상세포는 이제 염증 과정의 감쇠와 2차 손상 및 신경 퇴행 제한을 포함하는 복잡한 다세포 신경 보호 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고 있습니다2-6. 반응성 신경교증의 신경병리학적 특성은 오랫동안 잘 정의되어 왔지만, 반응성 신경교증을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘과 다양한 다운스트림 결과는 잘 이해되지 않은 상태로 남아 있습니다. 반응성 신경교세포증을 유발하는 메커니즘과 그에 따른 세포 및 분자 현상을 이해하는 것은 반응성 신경교세포의 신경 보호 특성을 촉진하는 동시에 해로운 영향을 완화하는 것을 목표로 하는 전략을 개발하기 위한 중요한 단계입니다.

여기에서는 찌르는 부상을 사용하여 성인 마우스의 전뇌에서 심각한 반응성 성상교세포증을 유도하는 방법을 보여줍니다. 부상을 일으키기 위해 특수 장비가 필요한 통제된 피질 충격(CCI) 또는 유체 타악기 손상(FPI)과 같은 다른 외상성 뇌 손상(TBI) 모델과는 달리, 전뇌 찌르기는 머리를 안정시키기 위한 입체 장치와 11번 메스 날만 있으면 됩니다. 따라서 전뇌 찌르기 병변 모델은 FPI 또는 CCI 손상을 생성하는 데 필요한 특수 장치에 액세스할 수 없는 광범위한 실험실에서 보다 광범위하게 액세스할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법을 통해 연구자는 강력한 신경교증 반응을 안정적이고 재현성 있게 트리거하여 후속 세포 및 분자 이벤트를 조사할 수 있습니다. 전뇌에 찔린 부상을 입은 동물은 수술에서 회복되면 특별한 치료를 받을 필요 없이 장기간 생존할 수 있으며 급성, 중간 또는 만성 연구를 위해 군집으로 돌아갈 수 있습니다. TBI의 FPI 또는 CCI 모델보다 임상적으로 번역할 수 없지만, 찌르기 손상으로 인한 전뇌 병변은 중추신경계에 대한 외상 후 반응성 신경교증 및 기타 신경병리학적 사건의 기저에 있는 기본적인 생물학적 메커니즘을 조사하기 위한 간단하면서도 유용한 실험 모델로 작용합니다.

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프로토콜

혼합 C57BL / 6 배경에 성인 (3-4 개월) 수컷 마우스는이 프로토콜에 사용되었다. 동물은 12 시간의 빛 / 어둠주기에 보관하고, 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있게 하였다. 이 프로토콜에서 수행되는 모든 절차는 드렉 셀 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 외과 영역 준비

  1. 70 % 에탄올로 수술 테이블을 소독 한 후 흡수 패드 전체 수술 벤치를 커버하고 정위에 인접 수술 도구를 준비.
  2. 조작 암없이 정위 장치를 설정합니다. 정위에 가열 패드를 배열하고 37 ℃로 설정합니다. 동물과 가열 패드 사이에 종이 타월이나 수술 패드의 작은 조각을 배치하여 동물의 과열을 피하십시오.
  3. 멸균 가위를 사용하여, REA까지 0.9 % 멸균 식염수를 함유하는 무균 페트리 접시에 멸균 gelfoam을 작은 조각을 잘라사용 DY.
    참고 : 멸균 장비 및 무균 수술 소모품을 사용하여 멸균 작업 환경을 유지한다. 필요에 따라 10 ~ 15 초 동안 비드 살균기에 침지하여 동물 사이 절차를 수행하는 동안 또는에서 수술 도구를 다시 소독. 소독, 필요에 따라, 70 % 에탄올로 손을 문질러서 절차를 통해 깨끗한 장갑을 유지한다.

수술 2. 준비하고 마우스

  1. (G) 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 무게.
  2. 이소 플루 란 유도 챔버 및 2 내지 5 L / 분으로 설정 이소 플루 란 기화기 산소로 놓고 마우스, 수술 적 단계의 마취에 약 3-5 분을 유도. 둔화 호흡과 고정을위한 모니터링합니다. 마우스가 완전히 발가락 핀치 반사를 이용하여 진정되어 있는지 확인합니다.
  3. 마우스가 완전히 진정 될 때, 정위 프레임에 배치 이소 플루 란에 튜브로 연결되어 코 콘에 코를 고정합니다. 머리를 보장하는 것은 안정, 귀 운하에 귀 막대를 삽입하고 조입니다.
  4. 귀에 귀에서 머리를 면도하고, 눈 사이에서 귀 뒤쪽에.
  5. 이소 프로필 알콜과 betadine 요오드 용액, 3 회씩 교대 와이프로 피부를 소독.
  6. 수술하는 동안 건조되는 것을 방지하기 위해 두 눈에 인공 눈물을 적용합니다.

3. 수술

  1. 발가락이나 꼬리를 곤란하게하여 마취의 깊이를 모니터링합니다. 응답이없고, 호흡 속도가 느린 경우에도 마우스 적합한 수술면이다.
  2. 다만 거의 11 호 메스 블레이드를 사용하여 하나, 회사의 움직임에 귀 사이에 눈 뒤에서 시상 피부 절개를합니다. 옆으로 피부를 이동하고 지혈과 오른쪽 클립.
  3. 11 호 메스와면의 무딘면을 사용하여 상부 막 클리어 두개골 어플리케이터를 쳐 냈습니다. 면 팁 어플리케이터는 0.9 % 식염수에 담근으로 선택적으로, 두개골을 닦습니다. 완전히 건조하도록 허용합니다.
  4. 우리작은 통치자를 보내고, 영구 마커, 시상 봉합 (그림 1) 측 방향 1mm의 관상 봉합에 꼬리 및 1mm의 개두술의 왼쪽 가장자리에서 개두술의 전방 경계를 표시합니다. 그리고 시상 및 관상 봉합, 각각 (그림 1)에서 4mm에서 개두술의 오른쪽 꼬리 경계를 표시합니다.
  5. 0.5 mm의 드릴 비트를 사용하여, 영구 마커 개요 다음 천천히 뚫어서 개두술을 시작한다. 완전히 두개골을 돌파하지 말아주십시오. 눌러 부드럽게 제 5 호 집게로 정수리 뼈의 고립 된 조각에, 부족한 부분은 압력에 방법을 제공합니다. 얇게 뼈 경계에 걸쳐 충분히 약한 경우, 뼈 조각 제거를위한 준비가되어 있습니다.
    참고 : 연구자의 경험에 어려움이 한 조각의 뼈를 제거하는 경우,이 뼈가 충분히 시추 중에 희석되지 않았 음을 시사한다. facilita 이후 동물에 더 두개골을 드릴 고려뼈 조각의 테 쉽게 제거.
  6. 23 G 바늘 장착 10 ㎖ 주사기를 사용하여, 고립 된 뼈와 천공 영역을 적시고 0.9 % 식염수의 소량을 적용한다.
  7. 정위 장비 조작 암을 연결합니다. rostrally 직면 블레이드의 날카로운면이 프로브 홀더에 새 11 호 메스 블레이드를 연결합니다.
    주 : 주동이와 꼬리 조직은 블레이드의 날카로운 무딘 에지를 경험하지만, 각각 관통 부상에 의한 기계적 손상이 병변의 범위에 걸쳐 비교이다. 우리는 주동이의와 꼬리 부분 사이 GFAP 발현 또는 확산의 상향 조절을 포함한 반응성 신경교 증의 주요 기능에 뚜렷한 차이가 관찰되지 않습니다.
  8. 길에서 조작 암을 유지, 신중하게 45분의 5 직각 집게를 사용하여 고립 된 뼈를 들어 올립니다. FUL 하나에 남아 뼈의 조각을 해내 레버리지를 사용하여 고립 된 뼈와 리프트의 측면에 포셉의 끝을 삽입L 운동.
    참고 : 뇌를 찔러 또는 두개골 아래에 경질을 방해하지 않도록주의하십시오.
  9. 흠뻑 흡수 젤 거품의 작은 조각을 가지고 마르지 않도록하고있을 수있는 혈액을 흡수하기 위해 노출 된 뇌에 배치합니다.
  10. 젤 거품이 장소에 있으면 제자리로 조작하는 사람의 팔을 스윙 젤 폼을 통해 개두술의 중심에 블레이드를 조정합니다. 젤 거품을 제거하고 끝이 경질을 천공없이 경질에 닿을 때까지 블레이드를 내립니다. 마크 지느러미 / 정위의 수직 팔에 버니어 스케일을 사용하여 복부 좌표.
  11. 조작 암을 사용하면, 천천히 블레이드를 뇌에 정확하게 3mm를 내립니다. 이것은 조작자 암에 버니어 스케일 표시를 사용함으로써 달성된다. 잎이 5 ~ 10 초 동안 제자리에 머물 수 있도록합니다. opposi로 이동하기 전에 개두술의 주동이와 꼬리의 경계에 도달하는 날을 허용 세 번이 꼬리 지느러미에 블레이드 첨부 주동이와 정위 팔을 이동테 끝.
    참고 : 경질 블레이드를 삽입하기 전에 제거되지 않습니다. 인 쥐 경질, ~와 대조적으로, 두께 80 μm의 7은 마우스 경질 상당히 얇은 (몇 세포층 두께) 및 삽입 중에 메스 블레이드에 상당한 저항이 발생하지 않는다. 각 동물 일관된 부상을받을 수 있도록하기 위해 각 마우스의 새 메스 블레이드를 사용합니다.
  12. 천천히 뇌에서 블레이드를 제거, 정위 팔을 올립니다. 블레이드의 제거 후, ​​즉시 초과 혈액이나 액체를 흡수하는 뇌 표면에 gelfoam을의 또 다른 조각을 배치합니다.
  13. 한편, 정위 팔을 제거하고 11 호 메스 블레이드 폐기하십시오. 출혈이 중지되면, gelfoam을 제거합니다.
  14. 이러한 에틸 론 또는 prolene의 비 흡수성 봉합사와 피부를 봉합에 의해 상처를 닫습니다. 봉합사는 수술 후 9~10일 제거해야합니다.
  15. 홈 케이지에 마우스를 반환하고, 마우스 난방 시스템에 천천히 복구 할 수 있습니다고통의 흔적에 대한 G 패드와 모니터. 이소 플루오 란 마취 유도 회복은 일반적으로 이소 플루오 란에서 꺼낸 후 2-5 분 이내에 발생한다. 이 흉골 recumbancy을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
  16. 수화을 보장하기 위해 락 테이트 링거액 피하의 0.5 ml의 관리를 선택합니다.

4. 포스트 수술 케어

  1. 밀접하게 식민지로 돌아 가기 전에 마취에서 회복 될 때까지 수술 후 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
    1. , 수술 후 통증과 불편 함을 줄일 즉시 절차에 따라 IP 주입에 의해 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀을 관리합니다.
    2. 거동이 운동, 정리의 부족, 또는 체중 감소와 같은 고통의 심각한 징후 수술 후 2-3 일 동안은 동물을 관찰한다. 고통의 이러한 징후를 보여주는 동물을 안락사 및 연구에서 제거합니다.
  2. 스탠에 의해 동물을 안락사, 손상 조직의 조직 병리학을 검사하려면dard intracardial 관류.
    1. 간단히, 케타민 / 자일 라진의 과다 복용과 동물을 마취 한 후 intracardially 15 ~ 20 ml의 0.9 %의 NaCl로 관류, 또는 간은 실험의 결론에 4 % 파라 포름 알데히드의 60 ml의 다음에, 피 제거 될 때까지.
  3. 30 % 자당 용액에 전송하기 전에 4 % 파라 포름 알데히드에 2-4 시간 동안 두뇌 및 사후 수정을 해부하다. 가르시아 8,9에 설명, 또는 표준 조직 학적 또는 면역 조직 화학적 방법에 의해 섹션 40 ~ 60 μm의에서 저온 유지 장치에 두뇌 및 프로세스.

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결과

이 절차를 겪는 동물이 필요하지 않기 때문에, 수술후 치료 전문 단기 또는 장기 생존 시간주기 쉽게 손상 후 급성 또는 만성 병리학 조사 할 필요성에 따라, 연구에 포함된다. 이러한 GFAP와 소마의 비대의 상향 조절 반응성 신경교 증의 주요 기능은, 일찍 부상 다음 2~3일으로 관찰 할 수있다. 반응성 성상 세포에 대한 증식의 최고 단계는 부상 10 다음 일 ~ 5시입니다. 아래의 대표적인 결과 7 일 이전에 찔린 상처 병변을받은 동물입니다.

전뇌의 자상 부상 다음 전뇌의 일반적인 형태와 cytoarchitecture는 Nissl 염색 (그림 2)에 의해 가시화 될 수있다. 블레이드 트랙 병변의 중앙에 걸쳐 가장 두드러진이지만, 파괴 피질 cytoarchitecture 손상된 t의 입쪽와 꼬리 정도 밝혀문제를 해결합니다. 반응성 성상 세포는 GFAP (그림 3)에 대한 면역 조직 화학 염색으로 ...

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토론

그것은 두개골 또는 기본 두라는 시추하는 동안 손상되​​지 것이 중요합니다. 구멍이되지 두개골을 보장하기 위해 시추하는 동안 가벼운 압력을 사용합니다. 경질을 보장​​하기 위해 두개골 조각을 해제하는 것은 뼈와 함께 들어 올려되지 않은 상태뿐만 아니라,주의를 기울여야합니다.

전뇌의 자상 부상 모델 여기 중추 신경계에 침투 부상을 설명했다. 이러한 FPI 또는 CCI 등 TBI 모델보다 임상 적으로 번역하지만, 전뇌의 자상 병변 모델은 이산 CNS의 모욕에 의해 트리거 다양한 생화학 세포 또는 분자 사건을 조사하기위한 연구의 넓은 범위에 대한 유용한 도구 역할을한다. 인지 결핍이 래트에서보고되었지만, 3 주 양자 자상 부상 11 후에는 일방적 자상 병변 모델은 여기에 기술 된 바와 같이, 부상 세포 반응을 해결 연구에 가장 적합한 것을 주목해야한다. 이러한 재 등 다양한 신경 병리학 적 과정의 기본 관점,활성 신경교 증과 흉터 형성은 쉽게 관찰하고 연구 할 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

기술 지원을 해준 캐서린 클라크에게 감사드립니다. A.D.R.G.는 5K01MH097957-03의 일부 자금 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
StereotaxHarvard Apparatus726049
고속 마이크로 드릴Harvard Apparatus724950
스테인리스 스틸 메스 블레이드, #11MedVetJOR581S
5/45 각도 겸자Fine Science Tools11251-35
젤폼 스폰지 12cm x 7mmFisherNC9841478
Rb anti-GFAP다코  Z033429-2희석 - 1:20,000 (명시야); 1:1,000 (형광)
Shp anti-BrdUAbcamab1893희석 - 1:20,000 (명시야); 1:500 (형광)
Biotinylated goat anti-rabbitVector LaboratoriesBA-1000 희석 - 1:400 (명시야)
Biotinylated rabbit anti-sheepVector LaboratoriesBA-6000Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 488 goat anti-rabbitLife TechnologiesA-11008Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 568 donkey anti-sheepLife TechnologiesA-21099Dilution - 1:1,000 (fluorescence)
DAPI Nucleic Acid StainLife TechnologiesD3571희석 - 1:1,000(형광)
Cresyl Violet AcetateSigma AldrichC5042-10G희석 - 1%(명시야)

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