Method Article

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

DOI:

10.3791/52840

⸱

August 16th, 2015

 , 
1Centre for Cancer Research, Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 셀을 동기화할 필요 없이 셀 주기를 통해 셀을 추적할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 세포 동기화를 달성하는 것은 많은 세포 시스템에서 어려울 수 있습니다. 표준 관행은 특정 단계에서 세포주기 진행을 차단한 다음 축적된 세포를 방출하여 주기를 통해 일제히 진행되는 세포의 파동을 생성하는 것입니다. 그러나 일부 세포 유형은 이 차단이 독성이 있어 비정상적인 세포 순환 또는 대량 사멸을 초래합니다. 브로모데옥시우리딘(BrdU) 흡수는 개별 세포의 세포주기 단계를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 세포는 이 합성 티미딘 유사체를 통합하면서 S기 동안 새로운 DNA를 합성합니다. 짧은 기간 동안 BrdU를 제공하면 BrdU가 존재하는 동안 S 단계에 있던 세포 풀을 표시할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 세포를 세포주기의 나머지 부분을 통해 다음 복제 라운드로 추적할 수 있으므로 잠재적으로 독성이 있는 세포주기 차단을 유도할 필요 없이 세포주기 단계의 지속 기간을 결정할 수 있습니다. 또한 세포주기의 후속 단계에서 내부 및 외부 단백질의 발현을 결정하고 상관시키는 것이 가능합니다. 이는 세포주기 단계의 할당을 더욱 구체화하거나 체크포인트 활성화 또는 세포 사멸과 같은 다른 세포 기능에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

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세포주기 진행 동안에 세포주기 및 세포 기능에서 발생하는 변화의 평가는 생물, 특히 암 생물학의 여러 측면의 이해에 기초한다. 악성 종양의 치료를 위해 개발에 많은 제제는 세포주기 진행에 지대한 영향을 미칠 또는 세포주기 - 종속 메카니즘을 통해 세포 사멸을 유도한다. 세포주기의 특정 단계에서 세포주기 역학 또는 세포를 연구하기 위해, 세포를 동기화하는 것이 일반적이다. 그러나 동기화 방법은 잠재적 결과 얻어진 교란, 검토되고 세포에 해로운 영향을 가질 수있다. 1 시간에 걸쳐 하나의 세포에서 세포주기 진행의 최근 세포주기의 특정 단계에서만 존재하는 형광 태그 된 단백질의 사용이 허용 된 분석 (2) 그러나,이 세포는 유전자가 읽을 수있는 시스템의 사용을 제한하는, 이들 태그가 단백질을 발현하도록 조작 할 필요가 공부 될ILY 달성했다.

합성 (S) 상, DNA 복제와 유사 분열 (M) 여기서 세포 분열이 발생되어 세포주기는 두 개의 활성 단계로 구성됩니다. 이 단계는 세 갭 단계, G 0, G 1 및 G 2로 구분됩니다. 셀의 크기가 종래 세포 성장은 DNA 복제의 완료 사이하지만 세포 분열 전에 계속 DNA 복제와 G이....

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Protocol

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여기에 설명 된 프로토콜은 급성 림프 모구 백혈병 세포주 NALM6를 사용하지만, 다른 유형의 세포에도 적용 할 수있다.

1. 솔루션 및 시약

  1. 전체 RPMI
    1. 56 ml의 소 태아 혈청 (FCS) 및 RPMI-1640 배지 500㎖의 병에 200 ml의 5.5 mm의 L - 글루타민 추가.
  2. BrdU의 원액
    1. 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 32.5 mM의 BrdU의 (10 ㎎ / ㎖)을 준비합니다.
  3. BrdU의 전체 RPMI
    1. 전체 RPMI 10 ㎖에 BrdU의 주식 솔루션의 6.2 μl를 추가합니다.
  4. DNase의 솔루션
    1. 1 밀리그램의 DNase / DPBS에 mL로 준비합니다.
  5. 염색 버퍼
    1. DPBS에서 3 % 열 - 불 활성화 FCS 및 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 준비한다.
  6. 고정 버퍼, 투과성으로 버퍼 및 세척 버퍼의 정의에 대한 자료 목록을 참조하십시오.

2. 세포

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법은 다양한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. 일부 응용 프로그램은 여기에 설명되어 있습니다.

세포주기의 지속 기간의 평가

세포주기를 통해 세포로 운송하는데 필요한 시간을 결정하기 위해, 세포를 BrdU의 펄스 아래의 다양한 시점에서 수확한다. 평가의 간격은 분석되는 특정 셀에 적용될 수있다. 조혈 세포주는 표준 배양 조건에서 세포주기 단계의 길이를 결정하는 임의의 약물 치료의 부재하에 24 시간 동안 매 시간마다 측정 하였다. (2)가 24 시간에 걸쳐 NALM6 셀 스냅 분석의 선택을 보여준다. BrdU의 피 후 10 시간을 검출 (즉,도 1에서의 BrdU의 양 게이트 이내) BrdU의 펄스시의 S 단계에서 세포 인 세포주기의 단계에있는 세포의 피크, G (2) / M으로 진행ulse. S .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포주기 분석하는 능력은 암 생물학을 이해하고 세포 증식 및 성장에 영향을 미치는 두 약물 및 유전자의 작용 메카니즘에 중요하다. 전하는 세포 증식을 측정하는 검정법 다수 존재하지만, 대부분은 단지 본 셀 번호를 나타내는 측정 값을 제공한다. 이들은 직접 시각화 및 계산, 신진 대사 활동 또는 ATP 농도로 세포 수를 측정 분석을 포함한다. 이러한 방법의 많은의 주요 장점은 조건 또는 화합물의 큰 숫자를 선별하기에 유용하고, 마이크로 포맷과 자동화에 상대적으로 수행하기 쉽고 의무가 있다는 것입니다. 이러한 방법의 많은 단점은 죽음으로 인해 세포의 손실이 잠재적으로 세포 증식의 과소 평가로 이어지는 고려되지 않는 것입니다. 또한 이러한 방법은 대량 인구를 측정 및 단일 세포의 연구 또는 세포의 교통을 통해 허용하지 않습니다세포주기.

아마도 가장 신뢰할 수 있고 정확한 일반적으로 사용되는 확산 분석, 중 DNA 합성을 측정하는 것들이다. 기존의 세포 증식 분석은 몇 시간 밤새 새.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 미국 백혈병 및 림프종 학회(6105-08), NSW 암 위원회 보조금(13-02), NHMRC 선임 연구 펠로우십(LJB)(1042305) 및 프로젝트 보조금(1041614)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
APC BrdU 플로우 키트BD Biosciences552598BrdU 항체, 7-AAD 및 BD Cytofix/Cytoperm
Buffer(고정 완충액이라고 함)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer PlusBD Biosciences561651Permeabilization Buffer
Perm/Wash BufferBD Biosciences554723Wash buffer
DNaseD-4513
BD 팔콘 12 x 75  mm FACS 튜브BD Biosciences352008
BD Pharmingen 얼룩 완충제BD Biosciences554656
BD LSR FORTESSA 유세포 분석기BD BiosciencesFORTESSA
PipetmanGilsonP2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 mlLonza12-167F
DPBSLonza17-512F
태아 소 혈청FisherBiotecFBS-7100113
L-글루타민시그마G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine시그마B5002-1G
Falcon TC 150  cm2 벤티드 플라스크BD Biosciences355001
피펫 25  mlGreiner760180
Aersol 피펫 200  &마이크로; lInterpath24700
Aersol 피펫 1  mlInterpath24800
원심분리기SpintronGT-175R
CO2 인큐베이터바인더C 150
AF488 안티 히스톤 H3 Phospho (Ser10) 항체세포 신호9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) 토끼 mAb세포 신호2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) 토끼 mAb세포 신호2348S
NALM6 DSMZACC-128
BD Sigma라고 함

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
  2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  3. Harper, J. W., Elledge, S. J.

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Cell Cycle ProgressionFlow CytometryBrdU UptakeS Phase TrackingCell Cycle AnalysisDNA SynthesisCell SynchronizationProtein ExpressionCheckpoint ActivationCell Death

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