Ex vivo ERG는 동물 또는 인간의 분리된 온전한 망막에서 직접 망막 세포의 전기 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 망막 세포의 전기적 활동을 해부하기 위해 생체 외 ERG 기록에 일반적인 생체 내 ERG 시스템을 적용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
생체 내 망막 전위측정(ERG) 신호는 서로 다른 망막 세포 유형에서 비롯된 여러 중첩 구성 요소와 망막 외 소스에서 발생하는 잡음으로 구성됩니다. 생체 전 ERG는 동물 또는 기증자 눈의 손상되지 않은 고립된 망막에서 직접 망막 세포의 기능을 절개하는 효율적인 방법을 제공합니다. 또한 생체 외 ERG는 동물 또는 인간의 망막 조직에 대한 잠재적 치료제의 효능과 안전성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 상업적으로 이용 가능한 생체 내 ERG 시스템을 사용하여 분리된 마우스 망막에서 생체 외 ERG 기록을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 표준 생체 내 시스템의 광 자극, 전자 및 가열 장치를 맞춤형으로 설계된 표본 홀더, 중력 제어 관류 시스템 및 전자기 노이즈 차폐와 결합하여 상업용 생체 내 컴퓨터에 포함된 수집 소프트웨어와 함께 두 개의 망막에서 저잡음 ex vivo ERG 신호를 동시에 기록합니다 시스템. 또한, 특정 망막 세포 유형의 기능을 해부하기 위해 특정 ERG 성분을 제거하는 약물 치료와 함께 이 방법을 사용하는 방법을 보여줍니다.
서론
전위도 (ERG)은 빛에 의해 트리거 망막의 전기 활동을 기록 할 수있는 잘 확립 된 기법이다. ERG 신호는 망막의 세포 외 공간 저항에 흐르는 전류에 의한 방사 전압 변화 (감광체 바이폴라 셀의 축 방향)에 의해 주로 생성된다. 제 ERG 신호 은점 (1)의 표면으로부터 그렌에 의해 1865 년에 기록되었다. Einthoven 유쾌한 1908 2 B-, A-라는 세 가지 파도에 빛의 발병 ERG 응답, 및 C 파 지금 쌍극 세포, 감광체 주로 활동을 반영하는 것으로 알려져 있으며, 색소 상피를 분리 세포, 각각 3-8. 에르그 지역 (미소 전극과 (생체) 고립 그대로 망막에 걸쳐, 고립 된 눈 준비 (9)에서, 마취 동물 또는 (생체 내) 인간의 눈에서 3,10-15 또는에서 특정 망막 층을 기록 할 수 있습니다ERG) 4,16. 이들 중에서, 생체 ERG 현재 망막 기능을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 또한 진단 목적으로 이용 될 수 있거나 또는 동물이나 환자의 망막 질환의 진행을 따라 비 침습적 방법이다. 그러나 생체 내 에르그 녹음은 종종 안구 생리 소음 (예, 호흡과 심....
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프로토콜
모든 실험 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라했고, 워싱턴 대학의 기관 동물 연구위원회에 의해 승인되었다.
1. 관류 및 시편 홀더 설정
- 실험의 날에 신선한 망막 관류에 대한 솔루션을 준비합니다. 증류수 및 탈 이온수를 사용합니다. 다음 세 가지 방법 중 하나를 사용합니다.
- 미디어와의 NaHCO3 1.9 G : '에임스 1 병 (1ℓ) 솔루션'을 에임스를 중탄산염이 함유 준비
- (MM)에 로크의 솔루션 준비 : 112.5 염화나트륨, 3.6의 KCl, 2.4의 MgCl 2, 1.2 CaCl2를, 10.0 HEPES를, 20.0 NaHCO3를, 3.0 나 숙시 네이트, 0.5 나 조미료, 0.02 EDTA, 10.0 포도당, 0.1 % MEM 비타민과 아미노산 산
- (MM)에 준비 HEPES 완충 벨소리 솔루션 : 133.3 염화나트륨, 3.3의 KCl, 2.0의 MgCl 2, 1.0 CaCl2를, 10.0 포도당, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH를1 M의 NaOH 5.8 ml의 ~ 7.5로 조정, 0.72....
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결과
우리는 암순응 야생형에서 플래시 응답을 기록 실험 프로토콜 표준 관류 다른 해결책 (도 2)를 사용하여 상술 한도 1에 도시를 수행하여 (WT) C57BL / 6 마우스의 망막. 응답 파형과 반응 속도뿐만 아니라로드 광 수용체의 민감도는 에임스 '와 로크의 미디어 (그림 2A와 B)에서 유사 나타났다. 한편, HEPES 완충 링거액 (NO 중탄산염 또는 5 % CO 95분의 2 %의 O 2)에 따라 응답 진폭이 상당히 작았 다. 우리는 또한 이러한 조건에서 B 파 안정성이 손상되었음을 발견했다. 40 μM의 지명 수배를 추가 (DL-AP4)의 세 가지 미디어 (그림 2D-F)에 효율적으로 긍정적 인 B 파를 제거했습니다. B 파의 제거는 뮐러 세포의 활동 (21)에 기인 한 큰 느린 음의 (그림 2D)를 밝혔다........
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토론
우리는 여기서 생체 ERG 어댑터와 함께 생체 ERG 시스템 구성 요소를 사용하여 두 개의 격리 된 마우스의 망막 동시에 고품질 생체 ERG 녹화를 얻기위한 중요한 단계를 보여준다. 본 연구에서 우리는 동일한 용액 (어느 에임스 ', 로크 또는 링거)과 동물 모두에서 망막 관류하지만 약물 테스트를 위해 상이한 솔루션 등 각 망막 관류하는 것도 가능하다. 고품질의 데이터를 획득하기위한 가장 중요한 단계는 고급 맞춤형 시편 홀더를 사용하고 희미한 적색 (또는 IR) 하에서 모든 샘플 준비 절차를 수행하여 전자 노이즈, 망막주의 해부 안정적인 비교적 빠른 관류 흐름으로부터 차폐되고 빛. 여기에 설명 된 방법은 생체 내 및 생체 외 망막 전위도 녹음에서 수행하는 두 망막 및 생체 내 망막 전위 설정의 이중 사용을 즉시 사용할 수 있습니다.
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공개 사항
세인트 루이스의 워싱턴 대학은 Xenotec, 사와 라이센스 계약을 가지고 있으며, 생체 어댑터의 판매 로열티를받을 수 있습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 EY019312과 EY021126 (VJK), 워싱턴 대학 안과학 교실 및 Visual 과학에 EY002687에 의해 지원되었다, 연구에 의해 실명을 방지 할 수 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 생체 내 ERG 시스템 | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| 생체 내 ERG 시스템 | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo 어댑터 | OcuScience | Ex VIVO ERG 어댑터 | www.ocuscience.us/id107.html |
| 해부 현미경 | North Central Instruments | Leica M80 | 모든 브랜드 |
| IR 이미터 | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler 야간 투시경 스코프 | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | 군용 제품. |
| 레드 필터 | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | IR 시스템 대신 사용할 수 있습니다 |
| 레드 헤드 라이트 | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont 핀셋 #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| 면도날 | 전자 현미경 과학 | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | a href="http://www.sigmaaldrich.com/">모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| pH 측정기 및 전극 | Beckman Coulter | pHI 350 | 모든 브랜드를 |
| 사용할 수 있습니다.NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M 솔루션 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M 해결책 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | 모든 브랜드를 사용할 수 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| 중탄산나트륨 | Sigma-Aldrich | S6297 | 모든 브랜드 |
| Ames 매체 | Sigma-Aldrich | A1420 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | 사용할 수 있습니다 모든 브랜드 |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | 브랜드 사용 가능 |
| 숙신산 디소듐 염 | Sigma-Aldrich | 224731 | 모든 브랜드 |
| L-글루탐산 | Sigma-Aldrich | G2834 | 사용 가능 |
| 모든 브랜드 D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | 브랜드 사용 가능 |
| Leibovitz 배양 배지 L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | 모든 브랜드 |
| MEM 비타민 | : Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM 아미노산 | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5 % CO2< / sub> |
참고문헌
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).
- Granit, R.
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재인쇄 및 허가
