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방법 논문

"환자와 같은"동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

12.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52858

⸱

2015년 10월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College of the City University of New York, 2Departments of Biology and Biochemistry, The Graduate Center of the City University of New York

이 논문에서

요약

암의 전이 확산 암 관련 사망의 주요 원인이다. 우리는 고형 장기의 종양에서 전이의 메커니즘을 연구하기위한 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델 시스템 구축을위한 우리의 생존 수술 방법에 대한 심층적 인 설명을 제공한다.

초록

암 관련 사망의 대부분은 원발성 종양 자체보다는 암의 전이에 의해 발생합니다. 그러나 암 전이의 기전은 아직 불분명합니다. 동물 모델은 메커니즘을 규명하고 전이성 암 치료를 위한 새로운 전략을 평가하는 데 필수적입니다. 여기에서는 고형 장기 종양의 전이 메커니즘을 탐색하기 위한 "환자와 유사한" orthotopic syngeneic mouse model에 대한 심층적인 설명이 제공됩니다. BNL 1ME A.7R.1 마우스 간세포 암종 세포를 근친 야생형 면역 유능 실험실 마우스 균주 BALB/c의 간(기원 기관)에 직접 이식하는 생존 외과 이식에 대해 설명합니다. 이 방법론의 성공과 재현성은 고형 장기암 전이의 생물학적 메커니즘을 밝히는 데 널리 사용할 것을 권장합니다.

서론

간세포 암종(HCC)은 가장 치명적인 암 중 하나이며 예후가 좋지 않고 기대 수명이 낮습니다. 거의 모든 암 관련 사망은 발원 기관에서 다른 먼 장기로 질병이 전이되어 발생하기 때문입니다2-6. 간세포암 진행은 복잡한 과정입니다. 따라서 동물 모델에서 전이성 간세포에서 자연적으로 발견되는 종양 미세환경을 모델링할 수 있는 것은 인간에서 관련 메커니즘을 밝히는 성공적이고 유용한 방법임이 입증될 수 있습니다. 7불행히도 암 전이의 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 따라서 HCC3,5와 같은 암 전이의 기저 분자 메커니즘을 규명할 수 있는 동물 모델을 확립할 필요가 있습니다.

Mouse 모델 시스템은 메커니즘을 설명하고 전이성 인간 암의 치료를 위한 새로운 전략을 평가하는 데 매우 유용한 접근 방식입니다5,8. 현재 존재하는 다양한 마우스 모델 시스템은 질병의 복잡성을 올바르게 묘사하기 위한 연구자들의 노력에 대한 증거입니다5,8,9.

Ogunwobi와 동료들은 최근 HCC3의 전이 연구를 위한 새로운 정교소 syngeneic mouse 모델의 확립을 입증하기 위해 생존 수술 접근법을 사용했습니다. 그들의 연구는 공격적이고 전이된 간암의 특징을 요약하는 "환자와 같은" 마우스 모델을 확립했습니다3. 그들은 또한 이 마우스 모델 시스템이 순환 종양 세포의 생물학을 연구하는 데 사용될 수 있으며 암 전이3의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다.

이 논문의 목적은 HCC 전이3의 "환자와 같은" orthotopic syngeneic mouse model을 확립하는 데 사용되는 방법론을 자세히 설명하는 것입니다. BNL 1ME A.7R.1 마우스 HCC 세포를 근친 야생형 면역 유능 실험실 마우스 균주인 BALB/c3의 간(기원 기관)에 생존 수술을 사용하여 직접 이식하는 방법에 대해 설명합니다. 인간 종양 세포가 면역 결핍 마우스에 이식되는 다른 마우스 이종 이식 종양 모델과 달리 이 시스템은 공생학이므로 종양 전이에서 면역 체계의 역할을 연구하는 데 적합합니다3,5,8. 이 접근법은 고형 장기암의 전이 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용될 것입니다.

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프로토콜

윤리 선언문
모든 동물 실험은 뉴욕 시립 대학의 헌터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

주 : 에이트 BALB / c 마우스는이 실험 절차에서 사용 하였다. 다섯 BALB / c 마우스는 차 종양을 생성하기 위해 5 X 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포를 이식 하였다. 아니오 주입 세 BALB / c 마우스는 대조군으로 사용 하였다. BNL 1ME A.7R.1은 쥐의 비 종양 간세포 세포주 BNL c12에에서 화학 변환에 의해 유도 된 쥐의 간세포 암 세포주이다. BNL 1ME A.7R.1는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)로부터 수득 하였다.

1. 사전 수술

  1. 모든 생존 수술은 건강을 위해 그 쥐를 확인합니다. 마우스가 건강하도록하려면, 피부의 텐팅 (tenting)에 의해 탈수의 징후를 검사합니다. 질병 또는 d의 증거와 마우스를 사용하지 마십시오이 실험에서 istress.
  2. 그들은 저체중하지 보장하기 위해 마우스의 무게를. 무게가 적어도 16-20g 있는지 확인하십시오.
  3. 마우스 당 주입 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 마우스의 간세포 암 세포를 준비합니다
    1. BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포의 70 % 융합 성 세포 배양 접시 - 10 ml의 60 %에서 대기음 매체. 5 ml의 PBS로 두 번 씻는다. 접시에 트립신 2 ML을 추가하고 5 분 동안 공기와 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ° C에서 품어.
    2. 그 후, 피펫 10 μL은 10 배의 배율 현미경으로 세포 계수에 대한 수동 혈구로 세포를 트립신. 4 개의 큰 코너에 위치한 사각형 셀들의 총 수를 카운트하고 세포의 총 수에 의해 희석 계수를 곱한다. 이어서, (ML 당 셀) 카운트 제곱의 수로 나누어 세포 농도 10 (6)에 의해 곱.
    3. 계산을 이용하여, 무균 마우스 당 500 만 세포를 수집1.5 ml의 마이크로 원심 튜브. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 레이블.
  4. 포스페이트 완충 염수 100 ㎕ (PBS)에 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 HCC 세포 재현 탁. 수술에서 이식까지 얼음이 세포를 보관하십시오.
  5. 마취의 유도 및 머리 오염을 방지하기 위해 멸균 장비와 물질을 멀리 클리핑 등의 수술에 대한 쥐의 준비에 필요한 활동을 수행합니다.
  6. 분당 1 L (약. 2.1 %)의 농도를 일정한 유량으로 산소와 함께 기화기 이소 플루 란을 사용하여 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스의 전신 마취를 유도한다. 주 : 시스템은 자립이며, 정밀 기화기, 산소 공급과 가스 / 마취제 소기 필요한 호흡 회로에 연결된 캐니스터 목탄을 포함한다.
  7. 마취는 수술 중 통증을 겪고에서 동물을 방지하기 위해 적절한 지 확인하십시오. 발가락 핀치를 수행하고 비 respon 위해 동물을 관찰siveness 마취를 확인합니다.
  8. 이 때, 코 콘에 밸브 라인, 인감 상자 열기를 전환합니다.
  9. 즉시 마우스를 마취로, 건조 및 손상 예방 조치로 각막에 안과 연고의 작은 금액을 적용합니다.
  10. 이어서, 노즈콘 제대로 (유지 마취)에 배치하고 연결하여, 준비 공간에 동물을 이동. 이 준비 영역에서 탈모에 의해 수술을위한 수술 절개 부위를 준비합니다.
  11. 수술의 영역이 다른 모든 활동이없는 위치에 있는지 확인합니다.
  12. 작업 표면이 견고하고 적절하게 소독, unsoiled과 혼란이없는 수술 전인지 확인하십시오. 리넨 또는 이상 수술 트레이의 살균 조각을 놓습니다.
  13. 수술 필드는 수술을 수행하는 사람 만 사용할 수 있는지 확인합니다. 수술 방 적절한 소독과 청소하고 적절한 세제를 휩쓸 및 분사되어 있는지 확인ctant.
  14. 그것은 또한 거리에 문 및 공기 흐름 등의 창에서 위치 사이트의 오염에 이르는 먼지를 확산 할 수 있는지 확인합니다.
  15. 멸균 악기 생존 수술을 수행합니다. 어느 제조업체의 권장하거나 오토 클레이브에 따라 살균제에 악기를 흡수. 사용할 준비가 기본 멸균 공급 장치를 사용합니다.
  16. 별도의 장비는 기능에 따라 멸균 지역의 오염을 방지하기 위해.
  17. 동물의 간을 액세스 할 수 절개 (중간 선 절개)의 사이트 주위에 약 1 인치를 면도. 수술의 사이트에서 멀리 동물에서 머리를 제거합니다.
  18. 면도 후, 비누 살균제 (betadine 수술 스크럽)와 영역을 문질러 멸균 PBS 용액에 과량의 소독제를 씻어. 약 5 분 동안 지속 전체 스크럽 과정이 여러 번 수행합니다. 제거하고 사용 장갑을 폐기.
  19. 그 후, 같은 surgic로 보호 복으로 변경알 가운, 스크럽 상단, 얼굴 마스크입니다. 다음으로, 수술 장갑 착용하기 전에 적절한 스크럽 솔루션 손을 소독. 참고 :이 흘리기 및 잠재적 오염 물질과 수술 부위의 오염 방지하기 위해 필요한 단계입니다.

2. 수술

  1. 마취의 전체 기간 동안 따뜻함을위한 외부 열원을 제공합니다. 마취는 체온 조절의 장애를 야기하기 때문에 동물은 일부 저체온증이 발생할 수 있습니다; 따라서, 체온을 유지한다.
  2. 수술을 통해 그 뒷면에 마우스를 놓습니다.
  3. 외과 테이프 조각과 수술 테이블에 앞 사지, 뒷다리와 마우스의 꼬리를 수정합니다.
  4. xyphisternum에 직선 절개 즉시 열등합니다.
  5. 간을 노출 멸균 자기 유지 외과 견인기를 사용합니다.
  6. 주사기 차분히, 20G 바늘을 갖는 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1를 포함하는 PBS 100 ㎕를 주입간 우엽에 마우스 간암 세포.
  7. 바늘을 제거한 후, 인해 간 높은 혈관에 잠재적 인 출혈을 멈추게하기 위해 적어도 1 분 동안 멸균 면봉을 적용합니다.
  8. 수술 클립을 사용하여 피부 폐쇄 다음 흡수성 봉합사와 피하 조직을 닫습니다. 그 후, betadine 스크럽과 함께 다시 한 번 상처를 청소하십시오. 참고 :이 수술 상처의 폐쇄를 보장합니다.
  9. 피하 생리 식염수 100 ㎕를 제공합니다.

3. 수술 후

  1. 수술 후 즉시, 마우스 조건 관리인에게 통지 수술 후 신분증 깨끗한 케이지에 마우스를 옮긴다. 음식과 물을 제공합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면, 초기 24 시간의 기간 후 수술 젖은 음식과 물을 혼자 보관하면 그냥 최선을 운임됩니다 수술을 한 마우스를.
  2. 38 ºC을 능가하지 열을 생성하는 가열 램프와 함께 동물을 따뜻하게 유지. 유마우스가 완전히 회복 될 때까지 온도를 측정하는 온도계를 SE는.
  3. 바람직하게는 종이 침구와 케이지 하우스 동물의 편안함을 보장합니다.
  4. 초기 복구 한 후, 불편 함, 출혈, 통증과 고통의 징후 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 통증을 완화하기 위해 프레 노르 핀 (0.05 -0.1 ㎎ / ㎏)을 얻었다. 밀접하게 약 2 시간 동안 활성 동작과 모양뿐만 아니라 물과 음식 소비를 모니터링. 외래 경우, 마우스의 정규 일반 주택을 다시 지역에 동물을 이동하고 24 시간 후 수술 6-12 시간 간격으로 모니터링을 계속합니다. 원하는 경우 체중 검사를 수행합니다.
  5. 동물이 문제가 회복 데 경우, 적절한지지 요법의 조치를 취할. 마우스는 복구 할 수없는 경우, 인도적으로 CO 2 질식 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 안락사. 안락사에 대한 승인 기관의 지침을 따르십시오.
  6. 수술 후 보통 observab입니다 간세포 암의 임상 적 증거를 확인몸 상태 점수 르로 크게 감소. 주 :이 시점에서, 일차 종양 가능성 간에서 개발 및 전이성 예금 가능성 폐에서 개발 하였다.
  7. 이 시점에서, 인도적인 안락사에 의해 실험에 참여 (실험 및 제어) 모든 쥐를 희생. 이산화탄소로 질식 생쥐 대상 : 매우 천천히 -10 5 분에 걸쳐 챔버 내에 이산화탄소를 방출. 이것은 호흡 정지의 원인이됩니다.

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결과

을 Balb / c 마우스의 간은 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포를 이식 하였다. HCC 개발의 임상 적 증거가 육십삼일 수술 후 관찰했다. 따라서, 마우스는 인도적으로 안락사시켰다. 검시는 안락사 쥐에 대해 수행 하였다. 폐 및 간을 절제하고, 조심 육안 검사를 육안 종양을 확인하기 위해 수행 하였다. 하나의 마우스에서 종양이 표면 복벽 (도 1a)에 일부 첨부 간 표면에서 발견되었다. 둘째 마우스에서 비정상적 간 예측이 관찰되었다. 이상은 매우 강력 피상적 종양 (그림 1B)처럼 보인다. 예상대로 제어 마우스에서 간 (도 1d) 및 폐 (도 1E)에 의해 입증되는 바와 같이, BNL 1ME A.7R.1 HCC 세포의 주입없이와 대조군 마우스는 종양이 전혀 개발되지. 또한, 종양을 가진 쥐에서 폐 다소 비정상적인 모습, 디스플레이출혈성 괴사 보내고 영역

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토론

이 문서의 방법에 대한 깊이있는 설명은 (그림 2)이 최근 Ogunwobi 및 간세포 암 전이의 동소 동계 마우스 모델의 성공적인 설립의 동료에 의해보고되었다 주어진다 3. 이 절차에 대한 종양의 테이크 속도는 일반적으로 높다. 우리는 이전에 100 % 3의 종양 걸릴 속도를 관찰했다. 그러나 테이크 속도는 연구자의 능력에 따라 변수가 될 수 있습니다. 훈련하에 새로운 대학원생 의한 최근의 실험에서, 종양 포획 율은 40 %로 낮았다. 대부분의 실험 4에서 종료되어 있지만 - 3 주 - 몸 상태 점수에 감소로 인해 6 주, 우리는 차 종양 (2)에 의해 설정 될 수있다 동일한 마우스에 동일한 세포의 피하 이식과 경험을 믿는다. 우리는 일반적으로 성공적인 실험에서 하나의 종양 결절을 볼 것으로 예상. 우리는 폐 전이가 4 사이에 개발 기대 비록 - 6 주, 그것은 conceiv입니다간에서 종양이 훨씬 일찍 일어날 수 있음을 수.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

기사를 교정해 주신 Pascal DuBois에게 감사드립니다. 저자는 또한 뉴욕 시립 대학의 헌터 칼리지 (Hunter College)의 동물 시설 직원에게도 감사를 표하고 싶습니다. 이 작업은 Hunter College에 대한 NIH RCMI 보조금의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마이크로 해부 핀셋 Roboz(RS-5040)팁 0.20 x 0.12mm
Graefe 마이크로 해부 집게, 톱니 모양의 곡선 팁Roboz(RS-5111)1 X 2 이빨, 곡선 팁 너비 0.6mm
마이크로 해부 견인기-아그리콜라(3 x 3 갈래)Roboz(RS-6501)무딘 3 X 3 갈래, 깊이 4mm, 스프레드 25 mm
마이크로 해부 견인기-Goldstein(3 x 3 갈래)Roboz(RS-6503)무딘, 3 X 3 갈래, 깊이 4 mm, 퍼짐 19 mm
Jameson Caliper (종양 측정)Roboz(RS-6466)80 mm/3 인치 스케일, 크롬 도금 
마이크로 해부 가위, 큰 링 시저, 직선적이고 날카로운Roboz(RS-5852)23 mm 블레이드, 길이 4인치, 평평한 샹크와 큰 링
섬세한 해부 절차를 위한 칼날이 있는 메스Roboz(RS-9861-36)
메스 핸들 Roboz(RS-9884)Solid
Littauer Stitch SissorsRoboz(RS-7074)길이 4.5인치
갈색 바늘 홀더, 쉽게 봉합할 수 있는Roboz(RS-7960)볼록한 턱, 미세한 톱니 반사
7MM 상처 클립과 reflex 7 클립 어플라이어Roboz(RS-9262)안전하고 안전한 상처 봉합 대체 방법
기구 트레이 및 뚜껑RobozRT-1350S
탈착식 블레이드가 있는 미니 클리퍼Roboz(RS-5903)
Germinator 500 (germ terminator) 건식 살균기RobozDs-400, Ds-401, DS-501마이크로 해부 기구의 빠른 오염 제거용.    기기는 15초 이내에 오염을 제거합니다. 
Microinjection 바늘VWRBD30512525G 바늘
Roboz(RS-9262)안전하고 안전한 상처 봉합 대체 방법

참고문헌

  1. Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
  2. Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
  3. Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
  4. Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
  5. Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
  6. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
  7. Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
  8. Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
  9. Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
  10. Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
  11. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
  12. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
  13. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
  14. Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
  15. Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).

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