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방법 논문

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

12.1K 조회수

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DOI:

10.3791/52861

⸱

2015년 10월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College of The City University of New York, 2Departments of Biology and Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

이 논문에서

요약

순환 종양 세포(CTC)는 종양 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 간세포 암종(HCC) 전이의 syngeneic mouse tumor model의 전혈에서 CTC를 분리 및 증식하는 방법을 설명합니다.

초록

암 전이는 암 관련 사망의 가장 큰 원인입니다. 최근 연구에 따르면 순환 종양 세포(CTC)가 암 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 실제로, CTC의 수는 종양 크기와 상관관계가 있습니다. 여기에서는 간세포 암종(HCC)의 syngeneic mouse model에서 CTC를 분리 및 증식하는 방법론에 대한 자세한 설명을 제공하며, 이를 통해 고형 장기 종양 전이의 잠재적으로 중요한 분자 메커니즘에 대한 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 효율적이고 재현 가능합니다. 이는 비침습적 기술이므로 합병증과 관련될 수 있는 인간 조직의 침습적 생검을 대체할 수 있는 잠재력이 있습니다. 따라서 여기에서 논의된 방법은 전혈 샘플에서 CTC를 분리 및 증식하여 검사하고 특성화할 수 있습니다. 이는 진단 및 맞춤형 표적 치료와 같은 임상 응용 분야에 대한 향후 적응 가능성이 있습니다.

서론

암 연구계는 1869년 토마스 애시워스(Thomas Ashworth)에 의해 처음 관찰된 이래로 순환 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)의 존재를 알고 있었다1. 그 이후로 CTC는 종양 전이 및 질병 진행2-5에 중요한 것으로 나타났습니다. 오늘날 고형 종양은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. CTC는 원발성 종양에서 유래하여 혈류를 통해 다른 장기로 이동하는 희귀 세포로, 그 중 극히 일부만이 궁극적으로전이 2-5로 발전합니다. 특히 종양 크기와 CTC 번호3,4 사이에는 양의 상관관계가 있습니다.

CTC 생물학에 대한 이해는 표적 치료법을 찾는 데 기여할 수 있습니다. 또한 CTC에는 진단 응용 프로그램이 있을 수 있습니다. 이러한 잠재적인 임상 응용 프로그램을 달성하려면 CTC 연구와 관련된 몇 가지 현재 과제를 극복해야 합니다. 한 가지 문제는 CTC가 단일 세포 또는 클러스터로 존재할 수 있으며 혈액 미세환경2에 대한 반응으로 표현형을 변경할 수도 있다는 사실과 관련이 있습니다. 더욱이, 혈액 10억 개당 10억 개의 혈액 세포 중 CTC의 수가 적기 때문에(밀리리터당 수백 개) 검출이 매우 어려울 수 있습니다6. 그럼에도 불구하고 최근 몇 년 동안 고형 장기암에서 CTC의 잠재적인 임상 적용에 대한 연구가 강화되었습니다.

이러한 노력에도 불구하고 CTC의 희귀성과 현재 사용 가능한 기술 도구의 부적절성으로 인해 CTC의 역할을 연구하고 이해하는 데 어려움이 지속되고 있습니다. 이러한 어려움에도 불구하고 임상 적용에 대한 엄청난 잠재력은 암 전이에서 CTC의 역할에 대한 연구를 계속하는 인센티브가 되고 있습니다.

우리는 최근 간세포암종(HCC) 전이5의 정소성 합성유전자 마우스 모델에서 세포 배양 CTC를 분리 및 증식하는 데 성공했습니다. 본 논문의 목적은 성공적인 방법론의 모든 측면을 자세히 설명하는 것입니다. 이 방법론의 중요성은 배양 인간 CTC를 성공적으로 분리 및 증식시키기 위해 이 접근 방식을 수정할 수 있다는 사실에 있으며, 따라서 CTC 생물학의 시험관 내 연구 가능성을 높일 수 있습니다.

CTC의 사용에 대한 여러 가지 잠재적인 임상 응용이 있다. CTC는 예후, 반응 모니터링, 스크리닝, 종양 분자 변화의 동적 모니터링 및 개인 맞춤형 치료에 유용할 수 있다4. 따라서 CTC의 생물학에 대한 더 나은 이해는 임상적 영향을 미칠 가능성이 높습니다.

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프로토콜

윤리 선언문 : 모든 동물 실험은 뉴욕 시립 대학의 헌터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 사전 실험 절차

  1. 동물 시설에 도착하면, 처음에 필터링 상단과 우드 칩 침구와 케이지에 3 BALB / c 마우스를 수용. 쥐가 음식, 퓨리나 설치류 우, 물을 무료로 이용하실 수 있습니다 있는지 확인합니다. 케이지가 일주일에 한 번 청소해야합니다 동안 침구와 음식은 일주일에 두 번 변경해야합니다.
  2. 분당 1 L의 일정한 유속으로 산소와 함께 기화기 이소 플루 란을 이용하여 마우스의 전신 마취를 유도한다. 이 시스템은 자립하고 정밀 기화기를 포함한다.
  3. 연결된 정밀 기화기와 가스 / 마취제 시스템을 갖는 플라스틱 상자에 위치 동물. 동물이 시점에서 2 기화기을 절감, 의식이 될 때까지 처음에 2.5 기화기를 설정합니다.
  4. 이 때, 스위치밸브 라인, 박스로 밀봉하고 노즈콘에 개방.
  5. 노우즈 콘 (유지 마취)의 설치 위치와 접속하여, 준비 공간에 동물을 이동.
  6. 마우스 당 주입 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 마우스의 간세포 암 세포를 준비합니다. BNL 1ME A.7R.1 매체에서 성장한다 (10 % 열 불 활성화 FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민 L) 및 5 %의 공기와 가습 된 배양기에서 37 ℃에서 세포 배양 접시에서 배양 CO 2.
  7. 주사기 20 G 바늘을 갖는, BALB / c 마우스의 간의 로브로 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포를 함유하는 PBS의 임플란트 100 μL은 차 종양을 생성한다. 착상 후, 집 착상 전 같은 집의 요구 사항에 케이지의 BALB / c 마우스.
  8. 실험 종료 시점에서, 간세포 암종의 임상 적 증거는 신체 상태의 상당한 감소로서 관찰 할(일반적으로 사주 후 감지) 점수. 이 시점에서, 증착물은 전이성 폐에서 형성 한 주 동안 종양 간에서 개발 한 것을 가능성이있다. 그 후, 종양 세포 순환의 분리 및 전파의 과정을 시작.

종양 세포 분리를 순환 전혈 2. 컬렉션

참고 : 제대로 수술 영역을 소독하고 혼란없는 있는지 확인합니다. 모든 수술 도구를 압력솥 또는 제조업체의 권장 사항에 따라 살균제에 담가

  1. 실험 종료 시점에서 인도적인 안락사 (종양 개발의 임상 적 증거)에 의해 쥐를 희생. 마우스의 Euthanization은 이산화탄소 질식을 포함한다. 마취를 확인하기 위해 적절하게 마우스를 관찰하는 것은 제대로 배포됩니다. 호흡 정지의 원인을 10 분 - 이산화탄소 5 걸쳐 챔버 내로 서서히 방출한다. 심장 내 방혈 및 cervic에 의해 수행알 전위. (5)
  2. 전체 혈액의 수집을 위해 1 ML의 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용합니다. 0.01 ㎖의 헤파린 주사기 Heparanize. xyphisternum 약 45 ° 각도로 떨어지는 바늘 즉시 찔린 피부. 심장에 구멍을 천천히 바늘을 전진하고 바늘의 각도를 낮 춥니 다. 꾸준히 장소에 바늘과 주사기를 개최, 500 ㎕를 끌어 - 마음에서 전체 혈액의 1,000 μl를.
  3. 주사기와 바늘을 제거하고 미리 라벨링 1.5 ML의 발열이없는 튜브에 혈액을 전송합니다. 5 분 동안 1,167 XG에 1.5 ml의 무 발열원 튜브에 수집 전혈을 원심 분리기.
    주 : 원심 세 층으로 전체 혈액 샘플을 분리한다 : 적혈구, 버피 코트의 중간 박막과 상부 플라즈마 층으로 이루어진 하부 층 또는 헤마토크리트.
  4. 피펫 조심스럽게 플라즈마를 제거하고 푸르트에 대해 별도의 1.5 ml의 발열이없는 튜브로 수집휴대없는 핵산 (7)의 검출과 같은 어 실험.
  5. 순환 성 종양 세포 (CTCS)의 분리를 위해, 적혈구 (RBC)의 용해에 대비 별도의 1.5 ml의 무 발열원 튜브에 버피 코트를 수집한다. 이를 버피 코트 층에 잔류 적혈구를 제거 할 필요가있다.

적혈구 (RBC) 용해 버퍼 3. 레시피

  1. RBC 용해 버퍼의 1 L 솔루션을합니다.
  2. 염화 암모늄 500 mL 및 트리스 500 mL로한다. 이어서 염화 암모늄 155 mM의 트리스 10 mM의 최종 농도와 적혈구 용해 완충액 1 L의 용액을 만들기 위해 혼합한다.
  3. 7.5의 pH로 완충 용액. 2-8 ℃에서 적혈구 용해 완충 용액을 저장하고, 직전에 사용하고 RT로 가져온다.

버피 코트 4. 적혈구 용해

  1. 수집 된 버피 코트를 포함하는 무균 무 발열원 1.5 ㎖의 튜브에 적혈구 용해 완충액 1 ㎖를 추가한다.
  2. 하여 튜브의 내용물을 혼합여러 번 반전. 벤치에 RT에서 5 분 동안 튜브의 내용물을 혼합하여 배양한다. 1,167 X g에서 5 분간 원심 분리하여 혼합 내용.
  3. 원심 분리 후, 펠릿 백탁이 얻어 질 것이다. 펠릿에 대한 중단하지 않고 차분히 10 % 표백제에 붉은 상층 액을 버린다. 3.5 - 펠릿 백탁 없으면 다시 DO 3.1 단계. 10 RBC 용해 완충액에서 항온 배양 시간을 증가 - 15 분 또한 도움이 될 수있다.
  4. 10 % 표백제의 생물학적 폐기물의 오염 제거는 24 시간 후 완료되면 안전하게 생물학적 폐기물을 폐기하십시오.

세포 배양 5. 전파

주 : 종양 세포는 전형적으로 세포를 빠르게 접시에 세포를 접종 원래 믹스 풍부 백혈구 증가하고있다. 매체의 반복 변경 CTCS 후속 통로 다음, 모든 백혈구 제거되고 CTCS의 비교적 순수한 인구가 남아있다.

  1. 후10 % 표백제로 상등액을 버리고, 세포 배양 물에서 증식을 위해 완전 배양 배지에서 적어도 한 번은 1 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)에 백탁 펠렛을 세척하고 재현 탁.
  2. 세척이 완료되면, 펠렛을 완전 BNL 1ME A.7R.1 배지 (FBS 불 활성화 된 10 %의 열, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2mM의 글루타민) 1 ㎖를 추가하고 배지에 펠렛을 재현 탁.
  3. 세포 배양 접시에 세포를 재현 탁 믹스 시드. 공기 및 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 배양 접시를 배양한다.
  4. 모든 2~3일 세포 배양 배지를 변경한다. 5-7일 후 CTCS는 세포 배양 접시에 부착 및 증식 시작한다. 이 세포들은 25 유로 이상 반복 동결 융해 사이클 (5) 후 가능한 유지됩니다.

간세포 암의 6 검증은 종양 세포 라인을 순환

  1. AP를 수행연쇄 반응 (PCR) 기반 방법 olymerase, 소설 CTC 세포주 원래 주입 BNL 1ME A.7R.1 HCC 라인처럼 마우스 세포 인 확립 확인하는 마우스 β 글로빈 유전자의 단지 하나의 특정 DNA 세그먼트를 증폭. 방법은 원래 기술과 Steube 등에 의해 확인되었다. 5,8
  2. 특정 항체를 사용하여 단백질 3 추천 (CREB3L3)를 결합 간세포 특이 마커 캠프 응답 요소에 대한 면역 염색 수행합니다. 이 설립 CTCS가 참으로 원래의 이식 BNL 1ME A.7R.1 세포주처럼 간세포 그 소설을 확인합니다. (5)

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결과

여기서 설명한 방법론은 CTCS가 분리 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 마우스는 인도적 실험 엔드 포인트에서 안락사시켰다. 프로세스 관련 이산화탄소 질식, 심장 내 방혈 및 경추 탈구. 과정의 주요 단계를 개략적으로는도 2에 도시되어있다. 내부 - 심장 방혈로 수집 전혈 시료는 전술 프로토콜을 이용하여 처리 하였다. 그 후, 원심 분리 RBC 용해시켰다 버피 코트 층을 결정하는데 사용 하였다. 이 후 PBS로 세척 하였다 백탁 펠렛을 수집하는 또 다른 원심 분리 단계에 이어, 세포 배양에서 전파 완전한 세포 배양 배지에 재현 탁 하였다. 올 수있는 문제가 얻어 펠렛은 색상이 명확하지 않을 수 있습니다. 이를 추가 시간을 행하여 아마도 15 분, 또는 -이 문제는 쉽게 10로 증가시켜 적혈구 용해 완충액에서 배양 시간을 변경함으로써 해결 될 수있다.BNL 1ME A.7R.1의 세포에 비해 세 가지 다른 생쥐는도 1에 도시되어 CTCS에서의 대표적인 이미지는 배양으로 ...

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토론

본 연구에서는 간세포암종이 있는 동계 마우스의 전혈에서 CTC를 분리하고 증식시키는 방법을 설명하였다. 이 작업의 목적은 암 전이 메커니즘에 대한 진행 중인 연구를 강화하는 것입니다.

많은 암의 예후가 좋지 않은 요인은 적시에 발견되지 않고 그에 따른 악성 종양의 광범위한 전파입니다3. CTC는 원발성 암에서 발생하며 혈류를 통해 먼 장기로 퍼집니다. 이와 같이, CTC는 암 전이에 중요하며 진단3,9,10과 같은 여러 임상 적용의 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 CTC가 췌장암, 전립선암, 유방암 등 다양한 암 유형에서 질병의 진행과 강한 상관관계가 있음을 보여주는 여러 임상 연구의 데이터에 의해 뒷받침됩니다3,11,12. CTC가 암 진단에 매우 유용할 수 있다는 사실에도 불구하고 수십억 개의 혈액 세포 중 극소수가 존재하기 때문에 CTC를 분리하고 특성화하는 것은 어렵습니다3,7.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

Ogunwobi 박사의 연구실은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 MD007599(National Institute on Minority Health and Health Disparities)의 소수 민족 기관 연구 센터 프로그램(Research Centers in Minority Institutions Program) 보조금으로 지원됩니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIHMD 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
헤파린 나트륨 소금 1 gVWR89508-852
BTX 튜브 마이크로 1.5 ml 투명 NSVWR89511-2541.5 ml  pyrogen-free eppendorf 튜브
바늘 멸균 Disp BD 25 G x 1 inVWRBD30512525 G 바늘
Slp 팁 SRNG 1 ml 팩당 200VWRBD3096591 ml 주사기 팁
주사기 1 ml leur lok Pk 100VWRBD3096281 ml 주사기
VWR 포셉트 티슈 6VWR82027-446포셉스
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100VWR25608-924Cyromold
Cryo-oct compund 4 ozVWR25608-930Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 VWR48311-703Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mmVWR48-382-128커버 유리
VWR 슬라이드 박스 트루 노스 FM PuVWR89140-278슬라이드 박스
Super HT PAP 펜VWR89427-058PAP 펜
물 RNASe 및 DNAse 무료 2 LVWR101454-204뉴클레아제 무료 물
버퍼 트리스 초순수 등급 500 gVWR97061-796트리스 버퍼
염화 암모늄 ACS 등급 2, 5 KgVWR97062-048염화암모늄 완충액
팔콘 조직 배양 접시 60 x 15 mm 스타일 폴리스티렌VWR353002조직 배양 접시
Clorox 살균 표백제, 일반VWR89501-620Clorox 표백제
PBS, 칼슘 및 마그네슘 없는 1x(인산염 완충 식염수)(500ml)Thermo Fischer Scientific21-040-CVPBS, 1x
DMEM, 1x  4.5 g/L 포도당으로 & 피루브산나트륨이 없는 L-글루타민Thermo Fischer Scientific10-017-CVDMEM BNL 1ME A.7R.1 세포용 1x 배지
Fetal Bovine SerumThermo Fischer Scientific35-010-CVFBS
페니실린 스트렙토마이신 용액, 100xThermo Fischer Scientific30-002-Cl페니실린 스트렙토마이신
Sorvall Biofuge picoThermo Fischer Scientific7500241113,000rpm 원심분리기
개

참고문헌

  1. Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
  2. van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
  3. Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
  4. George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
  5. Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765(2013).
  6. Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
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  8. Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
  9. Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).
  10. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
  11. Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
  12. De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
  13. Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
  14. O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).

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