본 명세서는 마우스의 모체-태아 계면(자궁, 십후 및 태반)에서 조직의 침투하는 백혈구를 분리하고 분석하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 대부분의 세포 표면 마커의 무결성을 유지하고 유세포 분석을 포함한 다운스트림 응용 분야에 충분한 생존 가능한 세포를 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
임신에서 면역 관용은 어머니의 면역 체계가 현상 태아에 동의하고 육성하기 위해 특유의 변화를 겪는 것을 요구한다. 이 허용 오차는 성교시에 시작 Fecundation는과 주입 중 설립, 임신 동안 유지된다. 산모 - 태아 관용의 활성 세포 및 분자 매개은 태반과 자궁과 탈락 막 조직을 포함하는 산모 - 태아 인터페이스로 알려진 태아와 산모의 조직 사이의 접촉의 사이트에 충실. 이 인터페이스는, 기질 세포 및 백혈구 침윤으로 구성되고, 그 표현형 풍부하고 임신에 걸쳐 변화. 모체 - 태아의 계면에 침투 백혈구 함께 임신 지탱 로컬 미세 환경을 만들 호중구, 대 식세포, 수지상 세포, 비만 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 및 NKT 세포를 포함한다. 이 세포 또는 inapprop 간의 불균형자신의 표현형에 riate 변경은 임신 질병의 메커니즘을 고려된다. 따라서, 산모 - 태아 인터페이스를 침투 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증으로 이어질 면역 메커니즘을 규명하기 위해 필수적이다. 본원에 기재된 단백질 분해 및 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리 collagenolytic 효소 칵테일 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 충분히 보존 항원 및 기능적 특성을 가진 가능한 백혈구 (> 70 %)의 높은 숫자의 분리 수 있습니다. 격리 백혈구이어서 면역 표현형, 세포 분류, 영상화, 면역, mRNA 발현, 세포 배양, 및 혼합 백혈구 반응, 증식 또는 세포 독성 분석 시험 관내 기능 분석 등을 포함한 몇 가지 기술에 의해 분석 될 수있다.
서론
특징적인 변화가 어머니의 면역 시스템 내에서 발생하는 경우 임신 면역 관용은 기간입니다. 이러한 변화는 어머니가 태아, 반 동종 이식 (1)을 허용 할 수 있습니다. 태아는 아버지의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 항원이, 태아 세포가 모체 순환 3에서 발견 된 표현; 그러나 태아는 4,5를 거부하지 않습니다. 이 수수께끼는 완전히 이해되지 않습니다.
가장 최근의 가설은 산모 - 태아의 허용 오차가 성교 중에 생성 및 6,7 Fecundation는과 만삭 임신 8 ~ 10을 유지하기 위해 유지되는 것을 말한다. 이 산모 - 태아 관용의 고장은 임신 10-16의 초기와 후기 단계에서 질병의 메커니즘을 고려된다. 모체 - 태아의 공차는 T 세포 (T 조절 세포, Th1 세포, TH2 세포와 Th17 세포), MAC 등 다양한 백혈구 하위 집단의 참여를 수반rophages, 호중구, 비만 세포, NK 세포, 및 NKT 세포, 수지상 세포 및 B 세포, 임신 15,17-19 걸쳐 밀도 및 위치 파악에 그 변화. 어머니의 면역 체계가 태아 항원 (20, 21)와 상호 ....
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프로토콜
이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 동물의 윤리적 인 승인은 지역 연구 윤리위원회와 윤리 심의 보드에 의해 제공되어야합니다. 동물의 혈액, 세포, 또는이 프로토콜에 언급 된 유해 에이전트와 작업 할 때, 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야합니다.
1. 마우스의 취급 및 조직 컬렉션
- 멸균 워크 스테이션을 준비하고 조직 수집을 위해 멸균 도구를 얻을 수 있습니다. 이러한 도구는 크고 작은 수술 가위, 집게, 미세 팁 핀셋 포함됩니다. (- 22 ° C (20))을 실온으로 평형 - (5 ㎖ 3) 1X 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 채워져 적절한 조직 이름으로 표시된 작은 페트리 접시를 포함합니다. (- 15 ml의 10) 또한 1X PBS 용액으로 가득 레이블이없는 큰 페트리 접시를 포함한다.
- 임신 한 마우스를 안락사 (10.5-19.0 일 후 교미 (DPC) 또는 인도하기 전에) 이산화탄소를 사용하여 (CO 2). 마우스를 안락사되는 것을 보장하기 위해, 자궁 경부 전위 기술을 사용합니다.
주 : 10.5 DPC에 앞서 수동 자궁 조직으로부터 탈락 조직을 분리하는 것이 곤란하다. 탈락 백혈구의 분리가 필요하지 않은 경우, 자궁 비 ....
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결과
모체 - 태아의 인터페이스에서 뮤린 조직의 절개는도 1에 도시되어있다; 이 절차는 복강 (도 1A, B), 주입 부위 (도 1d)를 포함한 자궁 뿔 (도 1C), 및 자궁 조직의 컬렉션 (도 1E), 태반 (도 1F), 및 탈락 조직을 개방 포함 16.5에서 (그림 1G)는 DPC. 그림 2는 고립 된 대 식세포의 형태를 보여줍니다 (F4 / 80 +) 자기 세포 정렬을 사용하여 16.5 DPC의 탈락과 자궁 조직에서 수집. 격리 식세포 (데이타 미기재) 사이토 카인을 방출 할 수있는 기능을 유지한다. 탈락, 자궁, 태반에서 분리 된 생존 세포의 수율이도 3에 도시하고, 세포 생존율이 모든 조직에서 70 % 이상이다.도 4는 p.......
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토론
산모 - 태아 인터페이스에 침투 백혈구의 풍요 로움과 표현형 특성을 기록하고 일관된 데이터의 수집은 임신 관련 합병증의 발병 기전을 이해하는 데 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 31,38,39,43-46 걸쳐 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 용이하게하는 기술되었다. 그러나, 각각의 기술은 다르고, 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소의 조합을 사용하여 상이한 요구 상이한 해리 시간을, 조직의 수량을 지정하지 않고. 본원에 기술 된 프로토콜은 높은 생존력과 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 허용하고, 밸리데이션 상세한 상업적 시약에 대한 정보, 버퍼 준비, 조직 수량과 배양 시간을 제공한다실험실.
백혈구 분리 공정의 가장 중요한 단계 중 하나는 티슈 해리이고; 이 단계는 표현형 특성 (47)에 사용되는 세포 외 단백질의 무결성을.......
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공개 사항
저자는 관심의 충돌을 공개하지 않습니다.
감사의 글
NGL은 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 비판적인 읽기 모린 McGerty 에이미 E. Furcron (웨인 주립 대학)을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell Separator | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μ m 사전 분리 필터 | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| 멀티스탠드 | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15ml 원뿔형 튜브 | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS 버퍼 | Militenyi Biotec | 실험실 준비 | (0.5% 소 혈청 알부민, 2mM EDTA 및 1x PBS, pH 7.2) |
| Reagents | |||
| Accutase 효소 용액 | Life Technologies | A11105-01 | |
| 안티 마우스 CD16/CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| 안티 마우스 세포 외 항체 | BD Bioscences/eBiosciences | 표 1 | |
| Sodium azide | Fisher | S227-500 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| LIVE/DEAD 생존 염료 | Life Technologies | L23105 | |
| 고정 완충 용액 | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS 완충 | BD Biosciences | 실험실 준비 | 0.1% BSA, 0.05% 아지드화나트륨, 1x PBS, pH 7.4 |
| 트리판 블루 용액 0.4% | BIO-RAD | 145-0013 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| 추가 기기 | |||
| 쉐이커가 있는 인큐베이터 | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| 유세포 분석기 | BD LSRFortessa | ||
| 원심분리기 | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| 진공 시스템 | 실험실 건설 | ||
| 인큐베이터 | Thermo Scientific | 인큐베이터 3307 | |
| 수조 | 정밀 | 51221035 | |
| 세포 계수기 | BIO-RAD | TC20 자동 세포 계수 | |
| 광학 및 형광 현미경 | Zeiss 및 Olympus | Zeiss LSM780 및 Olympus CKX41 |
참고문헌
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast.<....
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