올바른 조직에게 멀티 조직 블록마다 자리

요약

시편 오리엔테이션 태그 (SPOT)의 목적은 다중 조직 파라핀 블록에서 개별 조직 식별에 도움이되도록 배향 수단으로서 기능하는 것이다. 이러한 프로토콜은 일반적인 저가의 조직 학적 물질에서 쉽게 구성 및 파라핀 블록 및 섹션에서 신뢰할 수있는 시각적 마커 역할을하는 방법을 보여줍니다.

초록

다중 조직 파라핀 블록 효율성 실험 균일 성 및 감소 된 비용과 시간과 높은 처리량 분석을 제공한다. 조직 마이크로 어레이는 다중 조직 파라핀 블록의 대부분을 구성하지만, 점점 연구자 기획 및 장비에 상당한 투자없이 조직 마이크로 어레이의 많은 장점을 제공 할 수있는 다수의 개인들로부터 더 큰 조직을 포함하는 비 - 배열 된 블록을 사용한다. 어떤 다중 조직 분석의 중요한 구성 요소는 각각의 조직을 식별하는 데 사용되는 배향 법이다. 방법은 적절한 방향 및 다중 조직 블록 조직의 식별을 유지하기 위해 존재하지만, 대부분은 배열 내의 유용한 공간을 소모 할 수 있고, 비 배열 블록에 적합하지 않은 및 / 또는 표준 조직학 실험실에서 제조하기가 어렵다. 표본 방향 태그 (스팟) 명확하게 파라핀 블록과 모든 조직 섹션 FO에서 볼 수있는 간단하고 저렴한 비용으로 방향 도구입니다배열 및 비 배열 레이아웃으로 R 신뢰성 시험편 식별. 그 자리는 조직에 대한 직접 수정을 필요로하지 않는 비 배열 블록에 대한 기존의 방향 방법에 비해 이점을 제공하고 조직 조각의 배치의 유연성을 허용한다.

서론

하나의 파라핀 블록에서 여러 개인에서 조직 샘플을 포함 할 수있는 능력은, 치료와 개인 사이에 쉽게 나란히 비교를 가능하게 슬라이드 사이의 변동성을 제거하고 절편과 표본을 염색의 비용과 작업 부하를 줄일 수 있습니다. 이러한 다중 조직 블록은 전형적으로 비 - 어레이 레이아웃 여러 개인의 조직을 포함하는 조직 마이크로 어레이를 하나 (TMA) 또는 파라핀 블록으로 제조된다. 샘플 정체성 유지는 여러 조직 분석의 성공에 매우 중요하다. 연구자들은 분석의 효율을 향상 슬라이드 사이의 변화를 줄이기 유용한 조직 자원을 절약하고, 시간과 실험 ^1의 비용을 줄이기 위해 자신의 개발 이후 TMAs 사용하고있다. TMAs의 올바른 방향 조직 코어 ^2-4 코어 기의 비대칭 배열 ^3,5- (예 contro 간의 공백, 행 또는 열을 포함하여 다양한 방법을 사용하여 달성 될 수있다치료 대 L), "비콘"코어 ^6, TMA 매트릭스 ³ 외부에 지정된 방향 코어. 이러한 방법 TMAs 잘 작동하지만, 대부분의 조직 코어가 시간이 지남에 소진 될 때 식별자가 혼동 될 수 있으므로 간격 및 공백 가치 TMA 코어 공간과 TMAs을 소비한다. 그들은 식별자로 균​​일 한 마이크로 어레이 코어 단단히 주문 패턴의 이상에 의존하기 때문에 또한 이러한 방법은 배열 형식없이 여러 조직 블록에서 사용하기에 적합하지 않다. 대부분의 비 배열 멀티 조직 블록이 수차의 랜드 마크로서 밖으로 서 만드는 구조적 배열 그리드를 표시하지 않습니다, 정의, 비 균일 한 조직을 수용해야합니다.

TMA, 가장 큰 단점 중 하나를 사용하는 많은 장점이 있지만, 항상 크게 불균일 ^한 조직을 반영하지 않고 코어의 작은 크기이다. 비 배열 다중 조직 블록 t 많이 제공그는 TMA의 장점,하지만 더 큰 조직 샘플, 또는 동물 연구에서 전체 기관을 포함한다. 하나의 코어를 사용하여 조직 마이크로 어레이는 관심의 단백질을 기반으로 전체 조직 섹션과 일치를 변화하고 많은 사람들이 증가 일치 ^7-11 여러 코어를 필요로한다. 때문에 복잡성과 일부 바이오 마커 표현형의 이질적인 특성으로 TMAs는 여전히 불충분 할 수있는 코어도 많은 수의 (> 10)을 사용하여 분석 ⁸ 마이크로 어레이 이외의 방법이 필요할 수 있습니다. 또한, TMA 건설은 기술적으로 까다로운 시간이 소요, 그리고 조직 Arrayer에 대한 초기 비용 및 투자 또는 액세스가 필요합니다. 비 배열 된 다중 조직 블록은 상당히 적은 시간과 노력으로 어떤 기본 실험실하여 이루어진 어레이 허용하거나 비용을 절감하고 분석을 단순화하기위한 수단으로 이상 조직을 요구하는 연구를 위해 유효한 대안이 될 수있다.

비 배열 멀티 조직 블록 마찬가지로 신뢰할가 필요하거나ientation 마커 샘플 ID를 추적하는, 그러나, 이들 마커의 개발이 제한되어왔다. 조직의 방향을 설명하는 문헌의 대부분은 잉크 ⁽¹²⁾ 조직을 문신 개별 조직 조각을 삽입에 대한 올바른 생리 학적 방향에 초점을 맞추고, 사전 처리 ^(13)에 한천 - 젤라틴의 조직을 미리 포함하고, 노치 ⁽¹⁴⁾ 또는 봉합사 ^(15)과 특정 조직을 표시 . 기능하지만, 이러한 방법은 그들의 한계에 다 조직 블록 마커로 적합하지 않습니다. 봉합 신속 통해 구분되며, 각 섹션에 표시되지 않을 수 있습니다. 처리 및 매립시 올바른 방향으로 조직을 유지 할 수 있습니다 한천, 젤라틴을 사용하여 기술을 사전 포함하지만, 파라핀 블록과 슬라이드에서 여러 샘플을 구별 할 수있는 시각적를 제공하지 않습니다. 조직에 노치 또는 염료 분석을 복잡하게하거나 중요한 형태 학적 정보를 폐색 수 있습니다. 또한, 조직의 정체성비 배열 다중 조직 블록 비대칭 배열로 조직 조각 매립 통해 유지하지만, 이것은 3 이상의 조직편 필요하고 조직 분석을위한 최적 배열에 대한 허용하지 않을 수있다.

표본 방향 태그 (SPOT)은 명확하게 멀티 조직 블록 조직을 식별 할 수있는 쉽고 저렴한 방법으로 개발하고 기존의 방향 방법에 비해 많은 혜택을 제공하고있다. 그 자리는 하이드 록시 에틸 아가로 오스 처리 젤 및 조직 마킹 염료, 구성 및 파라핀 (그림 2C) 침투 작은, 다채로운, 핵심입니다. 그 자리 코어는 멀티 조직 파라핀 블록에서 하나의 조직에 옆에 끝에 임베디드 블록에서 모든 섹션에 밝은 색깔의 점으로 나타납니다 - 명확 블록 및 섹션의 올바른 방향을 나타내는, (그림 1A D) 쉽게 조직을 식별합니다.

프로토콜

SPOT 1. 건설

1. 1 분 또는 완전히 용해 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브 또는 2 mL의 미세 원심 분리 튜브와 소용돌이에 1 ml의 조직 마킹 염료에 소 혈청 알부민 (BSA)의 50 mg을 추가합니다.
   참고 :이 프로토콜의 경우, 생화학 학년 BSA를 사용합니다. 다른 등급 및 순도가 테스트되지 않은 반면, 등급은 순도가 스폿의 성공에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
2. 젤이 완전히 용해 될 때까지 10 초 단위로 30 %의 전력에서 전자 레인지에 15 ML 원뿔 튜브에 열 9 ml의 히드 록시 에틸 아가로 오스 처리 젤.
3. 하나의 15 ML 원뿔 튜브에 용융 처리 젤 염료 BSA 솔루션을 결합하고 피펫으로 잘 혼합. 솔루션을 소용돌이.
4. 몇 시간 동안 또는 고체 때까지 냉장고에 원뿔 튜브를 놓습니다.
5. 부드럽게 원뿔 튜브에서 컬러 젤 플러그를 해제 길고 얇은 금속 주걱 또는 프로브를 사용합니다.
6. CU에 메스 또는 면도날을 사용하여겔은 5mm 두께의 부분으로 횡 플러그 t. 둥근 끝을 제거하고 폐기물 (그림 2A)로 처리.
7. 조직학 카세트의 평면 겔 플러그 부분을 놓고 1 시간 동안 70 % 에탄올을 잡아야합니다. 24 시간 동안 적어도 3 변경 사항을 70 % 에탄올 용액마다 2-4 시간을 변경합니다.
8. (1 시간마다 (예를 들면, 지방족 탄화수소 용액 3X를 비운 후 맑은 70 % 에탄올, 80 % 에탄올, 95 % 에탄올, 100 % 에탄올 (3X 변화) : 수동 에탄올 시리즈 (1 시간마다 통해 겔 부분을 처리 크실렌 대용품))이 프로토콜에서 사용 된, 크실렌은 수동으로 또는 조직에 processer)도 가능하며, 1 시간마다)을 위해 용융 파라핀 (3X로 침투.
   주 : 100 % 에탄올 중의 전체 탈수 이전에, 염료는 자동 조직 프로세서에서 다른 조직이나 시약 액에 영향을 미칠 수있는 겔 플러그로부터 누출된다. 이러한 수동 재수가 좋습니다으로, 그러나 자동 처리 EQU입니다동맹 효과적인.
9. 방법론 (그림 2B)를 포함 표준 파라핀을 사용하여 임베드 여러 처리 젤 섹션. 블록 냉각 및 경화 후, 실온으로 올 수 있도록합니다.
10. 블록 (그림 2C) 소진 될 때까지 포함 된 젤 섹션에서 자리 코어를 제거하기 원하는 크기의 피부 펀치 바늘을 사용합니다. 하나의 블록은 20 × 2mm ² 코어를 제공 할 수 있습니다. 시원한 지역에서 코어를 저장합니다. 이 프로토콜에 피부 펀치를 사용하여이 그림을 참조하십시오, 1.5 MM (그림의 1D 및 2D) 또는 2mm (그림의 1B, 1C 및 2C).

2. 동양 비 배열 블록에 지점을 사용하여

1. 원하는 위치와 함께 내장 될 수있는 개별 조직편 모두의 아이덴티티 및 스폿의 위치를​​ 나타내는 조직 배향도를 만든다.
   참고 : 조직의 방향도이 페이지를 포함하는지도 설명입니다식별자와 스팟의 위치에 표시된 모든 조직 조각의 A. 물리적 위치. 그것은 전자적으로 생성 할 수 있습니다 또는 손으로 그린​​ 수 있습니다. 이 그림은 가장 최종 제품을 사용하여 기술자 및 연구원에 맞는 어떤 방법을 사용하여 작성해야합니다. 샘플을 쉽게 현미경 분석에서 식별 할 수 있도록이지도는 연구자에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜에 사용 된지도는 손으로 그린​​되었다. 이는 조직의 각 부분과 스폿 그려진 실제 조직 블록 슬라이드와 같은 위치에있는 레이블이 조직 블록과 유리 현미경 슬라이드를 나타낸다.
2. 제대로 수익률을 자랑하는 처리 단계에 걸쳐 식별 유지 보장 정상적으로 조직편을 처리한다. 70 % 에탄올, 80 % 에탄올, 95 % 에탄올, 100 % 에탄올 (X3 변경), 지방족 탄화수소 류 (크실렌 대체) (X3 변화), 및 용융 된 조직 침윤 파라핀에서 :이 프로토콜의 경우, 1 시간 각각에 대한 조직을 처리 60 ° C (X3 변경).
   참고 :LL 조직은 표준 조직학 실험실 절차에 따라 처리해야한다. 이는 각각의 실험 방법, 조직의 크기 및 종류에 가변적 일 수 있지만, 이것은 배향 수단으로 자리를 사용하는 능력에 영향을 미치지 않을 것이다.
3. 조직의 방향도에 따라 할당 된 올바른 위치에 삽입 역에 조직 조각을 정렬합니다. 모든 블록에 자리하고 조직 조각을 준비하는 방법에 대한 기술자를 안내하는 기준으로 조직 방향 다이어그램을 사용합니다.
   참고로 도면에 그려진 매립 기술자가 정확히 동일한 구성에 매립 스테이션 조직편을 매립 역 옆 방향 손으로 그린​​ 맵을두고 배치 된이 프로토콜. 이것은 모든 조직 조각이 최종 제품에서 올바르게 식별으로 유지. 이는 다중 조직 블록 성공적인 사용에 절대적으로 중요하다.
4. 모든 조직 조각이 블록에 포함되는 것보다 그 자리 코어 키가 있는지 확인.
5. 표준 삽입 방법을 사용하여 조직의 방향도에 따라 적절한 위치에 다음 조직 조각과 끝 (가로)에 지점을 포함시킵니다. 필요에 따라 파라핀이 자리 (들) (1-2 분) 이상 떨어지지 않을 정도로 응고 될 때까지, 집게로 똑바로 자리 (들)을 누르고 있습니다.
6. 표준 방법을 사용하여 그 자리에 절과 얼룩 파라핀 섹션.
   1. 섹션은 양전하를 띤 유리 슬라이드에 40 ℃의 물을 욕조에 떠 및 부착 할 수 있도록 허용 (충전되지 않은 슬라이드는 테스트되지 않았습니다). 적어도 20 분 동안 60 ° C에서 건조 오븐에서 슬라이드를 건조.
   2. 다음의 시약을 통해 자동 염색기에서 슬라이드를 놓고 처리 : 크실렌 (크실렌 1-5 분, 자일 렌이, 3-2 분마다), 100 % 에탄올 (2 분), 95 % 에탄올 (약 1 분) 80 % 에탄올 (30 초), 70 % 에탄올 (30 초), 실행 수돗물 (2 분), 헤 마톡 실린 (1.5 분), 실행 수돗물 (3 분), 산 알코올 (1 분), 실행 수돗물 (2 분 ), BLuing 시약 (1 분), 흐르는 물 (2 분), 80 % 에탄올 (30 초), 에오신 (1 분), 흐르는 물 (10 초), 80 % 에탄올 (1 분), 100 % 에탄올 (3 변경 2 분마다), 자일 렌 (3 변경, 각각 30 초).
   3. 매체를 장착 장착 커버 글라스와 슬라이드를 커버.
      참고 :이 프로토콜에서, histotechnician 5 μm의 섹션에서 마이크로톰에 파라핀 블록을 절단. 우리는 자동 염색기를 사용이 프로토콜의 경우, 그러나 동일한 결과를 수동 염색을 통해 얻어 질 수있다.

TMAs 3. SPOT (수동 TMA 키트)

1. 2.1에 설명하고 현장의 원하는 위치 (들)을 할당 등의 조직 방향 다이어그램을 작성합니다.
2. 삽입 역에서 녹은 파라핀와 TMA 금형을 입력합니다. 몰드가 냉각 될 때, 조직 배향 그림에 표시된 원하는 위치에서 TMA 몰드의 마진 단부에 스폿 (S)을 포함. 필요에 따라, 파라핀 하 때까지 똑바로 집게로 자리 (들)을 보유의 그 자리 (들) (1-2 분) 이상 떨어지지 않을 정도로 응고.
3. 제조업체의 지시에와 배열 마진 (그림 2D)의 자리 (들)의 위치와 관련하여 따라 TMA 코어를 조립, 표준 단면 및 염색 프로토콜을 따릅니다.
   참고 :이 프로토콜에 사용되는 단면과 염색 방법을 볼 단계 2.6를 참조하십시오.

결과

그 자리는 모두 파라핀 섹션 라운드, 파라핀 블록에 밝은 색깔의 점 (그림 1A 및 2D)으로 표시하고 H & E 또는 IHC 염색 과정을 통해 유리 슬라이드에 남아 있습니다 (그림의 1B - 1D 및 2D를). 이 명백한 시각적 보조 모두 각각의 조직 조각을 식별 histotechnician 및 연구원과 histotechnician으로 통신을 단순화는 현미경에서 슬라이드에서 데이터를 수집 연구원에 조직 조각의 배열을 나타 내기 위해서 (때문에)이 시각적으로 사용할 수 있습니다. 조직 배향도 연구원에 제공 슬라이드 포함하고 현미경 분석시 혼란 없을 것이다 있도록 상세히 설명한다.도 2a는 고화 컬러 아가 로스 겔 플러그를 절편의 결과를 보여준다.도 2b는 매립의 결과를 나타낸다 절편을 아가 로스 겔 플러그파라핀...

토론

관광 명​​소의 성공적인 준비와 활용은 몇 가지 기술적 인 단계에주의 준수해야합니다. 히드 록시 에틸 아가로 오스의 녹는 천천히 낮은 열에서 수행해야합니다. 고온에서 빠르게 녹는 최적의 결과 미만의 아가로 오스의 일부 고장이 발생할 수 있습니다. 처리 조각으로 염료 함유 플러그를 절단 할 때, 각 부분의 두께가 4.5 mm 이상이고, 7 mm를 초과하지 않는 것을 보장한다. 그들은 두께가 균일하지 5mm만큼 둥근 끝은 폐기물로 제거됩니다. 5mm 미만의 조각 인접 조직 재료의 피로에 앞서 절편에 의해 배출되는 위험이 짧은 스팟의 생성한다. 그 자리는 블록의 전체를 통해 존재하는 보장하기 위해, 조각 적어도 4.5-5 mm해야합니다. 왁스의 적절한 침투를 보장하기 위해, 그러나, 조각 7 mm를 초과하지 않아야합니다. 왁스 침투 용 염료 편 탈수 할 때, 염료는 로우에 조각이 약간 침출 것에탄올의 R 농도. 최종 제품에 영향을주지 않습니다 침출, 반점은 여전히​​ 강렬하게 염색하고 명확하게 볼 수 있습니다. 침출 비록 다른 조직...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
히스토겔 검체 처리 젤	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
조직 마킹 염료	삼각형 Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	모든 조직 표시 염료로 충분할 가능성이 높습니다.
Arraymold Kit A 2mm(60코어)	Arraymold	20015A	모든 수동 조직 어레이어가 유사하게 작동합니다.