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방법 논문

직접 마우스 외상 / 이소성 골화의 모델을 굽기

10K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52880

⸱

2015년 8월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry

이 논문에서

요약

이소성 골화의 아킬레스건 절개술 및 화상 손상 모델은 외인성 인자의 적용 없이 외상으로 인한 이소성 뼈 형성에 대한 신뢰할 수 있는 연구를 가능하게 합니다.

초록

이소성 골화(Heterotopic ossification, HO)는 주요 외상, 화상 부상 및 정형외과 수술 후에 형성되는 골격 외부의 뼈 형성입니다. HO 연구에 사용되는 대부분의 동물 모델은 BMP(bone morphogenetic protein), 외인성 세포 구조 또는 BMP 신호전달의 유전적 돌연변이와 같은 외인성 물질의 적용에 의존합니다. 이러한 모델은 유용하지만 대부분의 HO 사례를 유발하는 염증 상태를 정확하게 재현하지는 못합니다. 여기에서는 집중된 HO를 안정적으로 생성하는 마우스의 화상/건절개술 모델에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 신체 표면적의 30%를 생성하고, 등쪽 피부에 부분 두께의 접촉 화상을 입히고, 중간 지점에서 아킬레스건을 분할하는 것을 포함합니다. 예측 가능한 위치에서 HO를 유도하기 위해 외상성 손상에만 전적으로 의존하는 것은 내재적 생리학적 과정과 환경에서만 내연골 이소성 뼈 형성에 대한 시간 경과 연구를 가능하게 합니다. 이 방법은 외상으로 인한 HO와 관련된 염증 및 골형성 경로를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 이 모델에서 HO는 예측 가능한 위치와 시간 과정에서 발생하기 때문에 HO 형성을 방지하기 위한 조기 이미징 전략 및 치료 방식을 개선하기 위한 연구가 가능합니다.

서론

Heterotopic ossification (HO)은 골소성 세포가 골격 외부에 내연골 뼈를 형성하도록 비정상적으로 유도되는 이소성 뼈의 형성입니다. HO 형성 경로의 세부 사항은 아직 대부분 알려져 있지 않지만, 받아들여진 패러다임에는 염증 유발 사건, 허용적 틈새, 뼈를 형성할 수 있는 중간엽 줄기 세포의 세 가지 핵심 요소가 포함됩니다. 1-3 HO는 주요 화상 부상의 60% 이상, 전투 관련 부상의 65% 이상, 침습적 정형외과 수술 사례의 10% 이상을 합병증으로 만드는 흔한 동반 질환입니다. 4,5 그러나 HO는 국소 부상 부위 또는 그렇지 않으면 다치지 않을 수 있는 먼 위치에서 발생할 수 있기 때문에 HO가 형성되는 위치를 예측하기 어려운 경우가 많습니다. 이러한 위치의 가변성은 국소 표적 방식으로 반응성 뼈 형성을 방지하기 위해 예방적으로 개입하기 어렵게 만듭니다. 또한 FOP(fibrodysplasia ossificans progressiva)와 같은 선천적 형태의 HO도 있으며, 이 경우 환자는 경미한 외상이나 염증성 모욕에 반응하여 강력한 HO가 발생하기 쉽습니다. 형질전환 마우스를 사용한 강력한 동물 모델은 이 표현형을 재현하고 외상으로 인한 HO에서도 중요할 수 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 제공했습니다.6-9 비선천성 HO의 발병기전에 대한 중개 연구는 부상 자체에서 외인성 골유도 물질 및/또는 세포의 이식에 이르기까지 다양한 구조를 사용했습니다. 재질 보기 10-13

일

이전 연구에서 우리는 외인성 물질의 투여가 필요하지 않은 마우스의 HO 형성에 대한 간단하고 신뢰할 수 있는 모델을 검증했습니다. 14-17 이 모델은 HO를 시작하는 두 가지 주요 조건, 즉 국소 외상과 전반적인 염증을 생성했습니다. 이것은 아킬레스 건절개술(국소 외상)과 원거리 화상 손상(전신 염증)을 결합하여 달성되었습니다. 생쥐는 두 가지 치료를 동시에 받았고 조직학적, 방사선학적, 분자적 수단으로 분석할 수 있는 강력한 양의 HO가 발생하는 것으로 밝혀졌습니다. 흥미롭게도, 동시 화상 부상은 HO를 형성하고 발달 시간 경과를 가속화하는 HO의 양을 크게 증가시켰습니다. 14-16 HO는 건절개술을 받은 사지의 종골, 발목 관절 및 경골/비골 주변의 예측 가능한 부위에서 발생했다. 알려진 위치에서 HO 발달의 신뢰성은 이소성 골화의 초기 단계에서 분자 및 조직학적 특징에 대한 집중적인 검사를 가능하게 했습니다. 14,17 현재까지 건절개술과 동시 화상 부상을 입은 마우스(50마리 이상)의 100%가 HO가 발생했습니다. 또한 HO.15,16의 성장 패턴과 생화학적 구성을 조사하기 위해 종단 2D 및 3D 이미징 및 분광 분석을 수행했습니다

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프로토콜

윤리 문 : 실험 동물 연구를위한 연구소의 여덟 번째 판 (ILAR, 2011)과 같다 : 모든 동물의 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 가이드에 제공된 지침에 정의 된대로 좋은 동물 관행에 엄격한에 따라 수행 하였다 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (PRO0001553)에 의해 승인했다.

1. 마우스 외과 적 치료

참고 : 사용 8-10주 된 C57BL가 / 6 마​​우스. 다른 연령, 배경, 및 생쥐 균주는 또한 상이한 조건 또는 유전 적 테스트를 위해 사용될 수있다. 프로 시저의 건 절단술 부분에 대한, 얼굴 마스크, 헤어 모자, 멸균 가운, 장갑, 및 악기를 사용하여 멸균 조건을 유지한다. 외과 사이트는 무균 포비돈 - 요오드 살균 입체 재단으로 준비를해야합니다. 37 ° C의 소생 솔루션을 수의학 가열 패드를 사용하고 따뜻하게하여 체온을 피 administra 이전기.

  1. 2.5 % 흡입 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 쉽게 접근 배부 및 뒷다리 - 사지를 떠나 코 콘을 사용합니다. 점막의 적절한 호흡 속도와 착색을 유지하기 위해 이소 플루 란 관리의 속도를 조절하고 근육, 발가락 핀치, 각막 반사를 확인하여 마취을 보장합니다. 절차를 수행하는 동안 건조 눈 부상을 방지하기 위해 마우스의 눈에 개성 안과 연고를 적용합니다. 수술 필드 아래 수의학 가열 패드 또는 온수 순환 장치를 사용하여 적절한 체온을 유지한다.
  2. 무통 수술에 피하 직전에, 부 프레 노르 핀, 0.1 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
  3. 밀접하게 무릎 발 뒤꿈치에서 가위를 사용하여 왼쪽 뒷발에 수술 부위를 면도.
  4. 밀접하게 척추를 통해 시작과 등쪽 정중선의 왼쪽에 면도 영역을 확장, 화상 부상을 수용 할 수있는 영역을 적어도 2cm × 3 cm의 제거, 마우스의 배부를 면도.
  5. 3 교대 포비돈 - 요오드 스크럽을 사용하여 무릎에 뒷발을 포함하여 수술 부위를 준비합니다.
  6. 왼쪽 아킬레스 건의 안쪽면을 따라 세로 절개를 수행합니다. 아킬레스 건 쉽게 시각화 할 수 있도록 절개를 확장; 약 0.5 cm.
  7. 날카로운 조직 가위로 중간에 힘줄의 날카로운 해부와 아킬레스 건 절단술을 수행합니다. 건 아래에있는 조직면에서 조직 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 블레이드 건 중간에 때까지 평면을 따라 해부. 급격히 건을 절단하기 위해 가위 블레이드를 닫습니다.
    참고 : 비복근, 가자미근과 족저 건을 포함하여 모든 뒤쪽 힘줄의 포함을 확인합니다.
  8. 멸균 거즈로 압력을 적용하여 지혈을 달성 (이 최소한의 출혈을해야한다)와 5-0 vicryl 스티치로 피부 절개를 닫습니다.
  9. 대략 measuremen와 35g의 무게 알루미늄 블록 등의 부분 층 화상을 수행TS 2cm X 2cm X 3cm 17 초간 마우스의 등쪽에 도포 면도 수욕에서 60 ° C로 가열 하였다.
    주 : 그러나 즉, 블록에 추가적인 압력을 가하지 않도록, 블록의 전체 표면 영역은 마우스와 접촉하는 것을 보장하는, 마취 된 쥐의 상부에 블록을 놓아 적절한 화상 농도를 달성 할 중력 허용 장소에 블록을 들고있는 유일한 힘. 블록의 일 측면에 부착 된 얇은 플라스틱 핸들 온수욕에서 조작, 안정화, 및 검색을 위해 편리하다. 이는 약 30 %의 총 체 표면적이 8-10 주 된 C57BL / 6 마​​우스에 화상이 생성됩니다. 이 접촉 화상으로 인해 상처를 통해 화상 깊이의 균일과 동물 사이의 재현성에 다른 방법 (불꽃 또는 소독 번)를 통해 선정되었다.
  10. 거즈로 화상 부위를 건조하고 tegaderm 드레싱을 적용합니다.
  11. 따뜻하게 소생술 유체를 관리 : 락 테이트 링거액 1 ml에복강 내 주사하고 0.5 mL를 피하 주사. 소생이 한 시간 관리는 화상 부상과 건 절단술에서 복구에 적합합니다.
    참고 : 마우스가 완전히 회복 될 때까지 모니터링에서 깨끗한 케이지에 개별적으로, 다른 마우스와 주택 케이지에 집에 마취 된 쥐를 반환하지 않습니다. 일반적인 복구는 1-6 시간 내에 발생합니다. 굽​​기 사이트는 일반적으로 2~4주 내에 치유하고 깨끗한 주거 환경에서 보관하는 경우는 거의 창상 감염에 의해 복잡하지 않습니다.
  12. 부 프레 놀핀 0.1 ㎎ / ㎏ 피하 주사에게 절차에 따라 3 일간 매 12 시간을 관리 할 수​​ 있습니다. 적절한 간격으로 일련 μCT 검사와 HO의 성장을 모니터링합니다. 자궁외 뼈의 성장이 먼저 μCT에 의해 분명 약 삼주 수술 후입니다.
    참고 : HO 개발의 대부분은 수술 후 구주로 완료됩니다. 우리는 15 주에 검사 μCT 단일 엔드 포인트에 비해 15주에 대한 격주 호 볼륨 또는 반복 μCT와 위치의 차이를 스캔 관찰되지 않았다.실험의 끝에서, 제도적 지침에 따라 CO 2 흡입으로 모든 쥐를 안락사와 10 분 후 자궁 전위와 죽음을 확인합니다.

2. μCT 수집 및 분석

  1. 발생하기 쉬운 위치에 스캐너 침대에 마취 마우스를 고정합니다. 동 잡음 호흡 방지하기 위해 침대에 단단히 뒷다리를 테이프입니다. 이미지 보정을위한 마우스 아래에 팬텀이 포함 된 공기, 물, 및 하이드 록시 아파타이트를 포함합니다.
  2. 뼈 분석 소프트웨어를 열고 근위 말단 뒷발의 선단에 고관절에서 양쪽 뒷다리를 포함 ROI (region of interest)를 정의한다. 다음 매개 변수를 사용하여 이미지를 얻습니다. 80 kV로, 500 μA 및 1,300 밀리 초 노출, 48 μm의 복셀 크기를 14, 15를
  3. 에 해당 필드에 평균 밀도를 세 팬텀 챔버의 각 투자 수익 (ROI)을 그리기 및 입력하여 하운 스 필드 단위 (HU)에 이미지를 보정소프트웨어.
  4. 왼쪽 뒷다리의 경골 평행 동소 피질골 구조 및 HO의 묘사를위한 명확한 해부학 뷰를 허용하는 Z 축을 따라하므로 소프트웨어 "그래버"툴을 사용하여, 화상을 재 방향.
  5. HO가 발견 될 때까지 무릎에서 시작하여, 이미지 조각을 원심으로 스크롤합니다. 수동 스플라인 도구를 사용하여 발을 통해 또는 HO가 초과 될 때까지 원심 계속 매 5 번째 조각에 자궁외 뼈 주변의 투자 수익 (ROI)을합니다. 확장하고 모든 호를 포함하는 하나의 투자 수익 (ROI)에 함께 로아 스티치 추정 해 도구를 사용합니다.
  6. 3D 투자 수익 (ROI)을 확인하고 분석 메뉴를 선택합니다. 가장 뼈 윈도우 표시 하위 및 상위 임계 값을 설정하여 뼈의 양을 계산한다. 모든 검사에 대해 동일한 고정 임계 값을 사용합니다.

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결과

이 본 연구에서, 프로토콜은 외상의 이전에 발행 된 마우스 모델에 대한 설명 / 호. 14 ~ 17이 부상을 구울 부분 두께의 아킬레스 건 절단술 및 글로벌 염증 모욕과 동시에 지역화 근골격계 손상의 생성을 포함 유도 구울 수 있습니다. 이 시리얼 이미징 따라 할 수있는 건 절단술 사이트에서 반응 뼈의 안정적인 형성을 초래한다. 현재까지 모두 아킬레스 건 절단술을 유지하고 부상을 구울 수있다 (50 이상) 모든 마우스는 건 절단술 사이트에서 HO의 측정 가능한 양을 개발했다. 이소성 골 형성을 정량화하기 위해, 캘리브레이션 화상 μCT 프로토콜은 각각의 원하는 시간 - 시점에서 사용된다. 아킬레스 건 절단술과 함께 화상 부상의 추가는 상당한 HO의 유도에 중요한 것으로 입증되었습니다. 부상 모두가 동시에 일어나는 AC 전압 비교 절단술 사이트에서 이소성 골 형성되어의 양의 상당한 증가가있다hilles의 건 절단술 형 (그림 1). (17)

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토론

이소성 골화는 외상, 화상 및 침습적 근골격계 시술을 받는 환자가 직면하는 주요 기능 장애를 나타냅니다. 가장 위험에 처한 인구는 즉석 폭발 장치(IED)와 같은 메커니즘으로 인해 심각한 폭발 부상을 입은 현대 분쟁 중인 군인입니다. 18 개선된 방탄복과 전방 배치된 의료 부대는 주요 사지 부상의 생존율을 향상시킬 수 있습니다. 사지 부상의 초기 안정화 및 복구 후 이러한 환자는 HO 발병 위험이 높습니다.18 유병률과 의학적 부담에도 불구하고 HO 발달의 세부 사항에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 거의 없습니다. 특히, 관련된 정확한 수용체 및 신호 전달 경로와 HO를 담당하는 세포 계통에 관한 질문은 현재 중요한 조사 라인입니다. FOP 및 다른 형태의 선천성 HO와의 일부 유사성이 예상되고 최근 보고서에 의해 뒷받침됩니다. 8,14,17 트라우마에 대한 반응으로 내인성 생성 HO의 신뢰할 수 있는 모델은 이러한 노력의 핵심 도구입니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다

감사의 글

μCT 이미징 및 분석에 도움을 주신 UM의 Amanda Fair, CMI, Kathy Sweet 및 ORL에게 감사드립니다. 자금 지원: BL 1K08GM109105-01 및 성형 외과 재단 국립 기부상에서 자금을 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6 생쥐Jackson Laboratory6648-10주 된
생쥐 이소플루란 – FlurisoVET one, Boise, IDV1 501017
Buprenorphine – BuprenexReckitt Benckiser HealthcareNDC 12496-0757-10.3 mg/ml 용액
BetadineOwens and Minor, Mechanicsville, VA2047PVP202
5-0 Vicryl 봉합사Ethicon, Summerville, NJJ493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm3M1624W화상 부위를 제대로 커버하기 위해 반으로 잘라내
&마이크로; CT - GE eXplore Locus SPGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis ApplicationGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
기

참고문헌

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