방법 논문

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DOI:

10.3791/52886

⸱

2015년 6월 5일

 ,  ,  , 
1Pathology, Anatomy and Cell Biology, Thomas Jefferson University

이 논문에서

요약

여기에 설명된 것은 본래의 미세환경 내에서 상피 조직의 손상 반응 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 임상적으로 관련된 생체 외 모의 백내장 수술 모델의 확립입니다.

초록

상피 조직이 상처 복구를 수행하는 방법을 이해하는 데 가장 큰 장애물은 생체 내 상피 조직 손상과 밀접하게 모방된 환경에서 생체 외 상처 반응을 추적하고 조작할 수 있는 모델의 가용성이 제한되어 있다는 것입니다. 이 문제는 백내장 수술을 기반으로 임상적으로 관련된 상피 체외 손상 복구 모델을 만들어 해결되었습니다. 이 배양 모델에서는 상처에 대한 수정체 상피의 반응을 세포의 고유 미세환경에서 실시간으로 추적할 수 있으며, 상처 복구의 분자 매개체는 복구 과정에서 쉽게 조작할 수 있습니다. 배양을 준비하기 위해 눈에서 수정체를 제거하고 수정체 앞쪽을 작게 절개하여 수정체 섬유 세포의 내부 덩어리를 제거합니다. 이 절차는 수정체를 둘러싸고 있는 두꺼운 기저막인 수정체 후낭에 원형 상처를 만듭니다. 섬유 세포가 부착된 이 상처 부위는 수술 중에 수정체 캡슐에 연결된 상태로 남아 있는 수정체 상피 세포의 연속적인 단층 바로 옆에 위치합니다. 발달 과정에서 섬유 세포가 파생되는 세포 유형인 상처 입은 상피는 중간엽 전구세포가 수정체1에 내인성인 비멘틴이 풍부한 복구 세포 집단에 의해 상처 부위를 가로질러 집단적으로 이동함으로써 섬유 세포 제거의 손상에 반응합니다. 이러한 특성은 정상적인 상피 상처 치유 반응의 전형입니다. 이 모델에서는 생체 내에서와 마찬가지로 상처 복구는 이 생체 외 배양 시스템에서 고유하게 유지되는 내인성 환경에서 공급되는 신호에 의존하며, 이는 상처 후 상피의 복구를 조절하는 메커니즘을 발견할 수 있는 이상적인 기회를 제공합니다.

서론

임상 적으로, 모의 백내장 수술은, 여기에서 설명한 생체 상피 상처 치유 모델 부상에 응답하여 상피 조직의 복구를 조절 메카니즘을 조사하기위한 도구를 제공하기 위해 개발되었다. 이 모델을 창출을 목적으로 한 주요 기능은 밀접하게 복구 프로세스를 문화 설정, 2), 수리의 규제 요소를 변조의 완화에 부상에 대한 생체 반응을 복제하고 이미지 3) 기능 1) 제공하는 조건을 포함 실시간 전체에서. 과제는, 따라서, 세포의 미세 환경에서 원시 상피 상처 복구를 연구하는 것이 가능시킨 배양 모델을 생성하고 조작하는 것이었다. 이 상처 수리 모델의 유용성은 복구 프로세스를 조절하는 매트릭스 단백질, 사이토 카인 및 케모카인에서 내인성 시그널링 신호를 식별하기위한 새로운 가능성을 연다. 또한, 모델을 조사하기위한 이상적인 방법N 상피 창상 면적 2,3-을 다시 epithelialize하는 단체 시트 같이 부상 상피 4 집단 이주를 연출 기능 감긴 가장자리 간엽 리더 셀의 혈통을 결정하기위한 이동시킬 수있다. 이 모델은 또한 효과적인 상처 치유를 촉진하고 비정상적인 상처 수리 (5)을 방지 할 수 치료제를 식별하는 데 사용할 수있는 플랫폼을 제공한다.

가능한 상처 수리 모델의 수는 문화와 오늘 상처 복구 프로세스에 대해 알려진 대부분을 제공 한 생체, 모두, 이미있다. 이러한 각막 6-12 및 13-17 등 피부 손상 동물 모델에서의 기여를 포함하는 과정에 관여 할 수있는 모든 수리 매개체의 맥락에서 부상으로 조직의 반응을 연구 할 수있는 기회가있다 혈관 및 신경계. 그러나, experi 조작에 한계가있다생체 내에서의 정신적 상태 및 연속적으로 시간이 지남에 따라, 생체 내에서 수리 응답의 영상 검사를 실시 아직 가능하지 않다. 대조적으로, 이러한 스크래치 상처와 같은 대부분의 시험 관내 상처 수복 배양 모델들은 쉽게 조작 될 수 있고, 시간이 지남에 따라하지만 생체 조직에 상처 치유 공부의 환경 문맥이 부족하다. 생체 외 모델이 프로세스의 모든 시점에서 수리 분자 조절기를 조절하는 능력과 결합 된 세포의 미세 환경의 콘텍스트에서 시간에 걸쳐 연속적으로 부상 복구 프로세스를 연구하는 이점을 제공하지만, 이들에 맞 몇몇 모델이 있습니다 매개 변수를 설정합니다.

여기에 생리 상처 상피 조직의 반응을 재현 배양 치유 재현성 높은 생체 상피의 상처를 생성하는 절차를 설명한다. 조직 공급원, 생체 MOC으로 병아리 배아 렌즈 사용K 백내장 수술이 행해진 다. 렌즈는 무 혈관, 신경 지배, 및 관련 기질 (18,19)의 자유되지는 자체 포함 두꺼운 기저막 캡슐 내에 있기 때문에이 연구에 사용하는 이상적인 조직이다. 인간의 질환, 백내장 수술로 인해 렌즈의 혼탁으로 시력 상실을 해결하고, 렌즈의 대부분을 포함하는 렌즈 섬유 세포 덩어리의 제거를 포함한다. 다음은 백내장 수술의 비전은 인공 수정체의 삽입을 통해 복원됩니다. 백내장 수술 절차, 섬유 세포의 제거를 통해, 섬유 세포에 의해 점유되었던 렌즈 캡슐의 후방 영역의 재 상피화함으로써 응답 인접한 렌즈 상피의 상처 반응을 유도한다. 백내장 수술에서 가장 상처 복구 응답 같이 때때로 렌즈 후방 Capsu로 알려져 근육 섬유 모세포의 출현과 관련된 창상 치유 반응을 비정상적 섬유화 결과,이 발생제작 혼탁 20-22. 백내장 수술 상처 치유 모델을 생성하기 위해, 백내장 수술 절차는 생리 부상을 생성 병아리 배아로부터 제거 눈 렌즈에 모방한다. 렌즈 상피 세포에 의해 둘러싸인 매우 일관된 원형 상처 영역에서 렌즈 섬유 세포 결과 미세 수술 제거. 이 세포 집단 단단히 렌즈 기저막에 부착 된 캡슐 유지되며 외과 적 절차에 의해 부상한다. 상피 세포는 리더 셀 1로 복구 프로세스에 공지 멘틴 풍부한 간엽 세포 집단 이끄는 상처를 치유하는 내인성 기저막의 무 결함 영역으로 이동한다. 이 모델 부상 상피의 응답 쉽게 시각화 할 수 있고, 세포의 미세 환경의 콘텍스트에서 시간에 따라. 세포 발현 또는 상처 복구하는 역할을 할 것으로 기대 분자의 활성화의 변형에 용이하게 접근 할 수있다. 일의 강력한 기능모델 분리 및 상처 치유의 틀에서 마이그레이션 별 변화를 연구 할 수있는 기능입니다. 연구를 위해 세 유사한 생체 상처 치유 배양 다수를 준비하는 능력은이 모델의 다른 이점이다. 따라서,이 모델 시스템은 상처 치유 과정에 미치는 영향에 대한 상처 수리의 메커니즘과 테스트 치료제 떨어져 애타게 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 생체 모의 백내장 수술 모델은 손상 복구 메커니즘의 연구를위한 중요한 자원을 제공하는, 다양한 적용 가능성을 가질 것으로 기대된다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침을 준수합니다.

예 생체 상처 문화 렌즈 1. 설치 및 준비

  1. 멸균, 층류 후드 세 100mm 페트리 접시를 놓습니다. 실온에서, 중간 트리스 / 우선 당 버퍼와 배양 접시 두 개를 (140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 0.7 mM의 나 2 PO 4, 5 mM의 D-포도당, 8.25 mM 트리스 자료, 염산으로 pH 7.4까지 TD 버퍼)를 입력 세 번째 빈 떠나. 사전 따뜻한 배양 배지를 37 ℃로 O (미디어 (199)는, 1 % L- 글루타민 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된)
    참고 : 생체 내에서 발생으로 문화 매체를 치유 표준 상처, 무 혈청이다 그러나, 상처 수복 배양 혈청 또는 다른 인자를 포함 한정 배지 조건에서 성공적으로 성장시킬 수있다.
  2. 비옥 한 배아 D를 제거바깥 인큐베이터에서 15 화이트 레그혼 병아리 달걀 (부드러운 락과 37.7 ° C에서 개최)
  3. 세척 병에서 층류 후드 70 % 에탄올로 쉘의 깨끗한 외부에서 선택한 달걀을 놓습니다. 멸균 솔루션과 장비를 사용하여 층류 후드에서 무균 조건 아래 모든 절차를 실시한다.
  4. 빈 100mm 페트리 접시에 계란과 장소 내용을 균열. 표준 집게 및 미세 가위를 사용하여 배아 목을 벨. TD 버퍼를 포함하는 배양 접시에 병아리 배아의 머리를 놓고 제대로 배아의 나머지를 폐기하십시오. 선택적으로 15 분보다 더 짧은 시간에 대한 TD 버퍼 병아리 배아 헤드를 유지하지 않는다.
  5. 페트리 접시 뚜껑에 병아리 배아 머리를 놓습니다. 고정밀 집게를 사용하여, 다음과 같은 순서로 눈로부터 부착 유리체와 함께 렌즈를 제거한다. 눈 뒤쪽의 작은 개구부를 생성하기 위해 집게 눈 뒤쪽 핀치.
  6. 그런 다음, W 유리체 유머를 파악i 번째 집게 부드럽게 롤링 운동과 유리체에 예인선이 부착 된 렌즈 유리체는 눈에서 탈락됩니다. TD 버퍼를 포함하는 나머지 배양 접시에서 유리체 장소 렌즈 /. 렌즈는 더 이상 30 분 TD 버퍼에 남아 있도록 허용합니다.
  7. 해부 현미경 새로운 배양 접시 뚜껑에 렌즈를 이동합니다. 이 시점부터 해부 현미경 아래의 모든 단계를 수행합니다. 고정밀 집게 조심스럽게 렌즈 조직이 손상되지 않도록주의를 복용, 집게의 가장자리를 사용하여 렌즈가 빠질 된 모든 모양체 (색소 세포)를 멀리 브러시.
    참고 : 모양체 제거는 렌즈에 내생없는 종류의 세포가 상처 수리 문화에 포함되지 않도록합니다.
  8. 후방 렌즈 캡슐과의 관계에서 유리체 몸을 곤란하게하여 고정밀 집게로 유리체 유머에서 렌즈를 분리합니다.
  9. 높은 정밀도를 사용하여 작은 방울로 렌즈를 전송 겸자35mm 조직 배양 접시에 TD 버퍼 (약 200 μL)의.

2. 수행 모의 백내장 수술

  1. 이 위를 향하게하여 렌즈의 전방 측면에 35mm 접시에 TD 버퍼의 드롭 렌즈의 방향을.
    참고 : 렌즈의 앞쪽에 쉽게 렌즈 상피의 전방과 적도 지역의 경계를주의 조직의 밀도가 고리의 존재에 의해 식별됩니다. 대조적으로, 렌즈 섬유 세포가 부착되는 렌즈 캡슐의 후부에 마킹 부재가있다.
  2. 각 손에 하나 집게로 조직을 파지하여 두 고정밀 집게는 전방 렌즈 캡슐 렌즈 조직을 둘러싸는 굵은 기저막 및 관련 전방 렌즈 상피의 중앙에 작은 절개 (약 850μm)하게 사용 부드럽게 반대 방향으로 잡아 당 겼.
  3. 렌즈 용 티슈, dislod의 대부분을 구성하는 섬유의 균체를 분리렌즈 상피 세포에 첨부 파일에서 그것을 카 및 (그림 1A에서 모델링 고전적인 백내장 수술에 사용되는 방식) 수력 용출에 의해 수정체 낭 주변.
  4. TD 버퍼 300 μL와 27.5 G 바늘 끝 1 ML의 주사기를 채우십시오. 앞쪽에 렌즈 캡슐에서 만든 절개로 바늘 끝을 삽입하고 대한 중간 렌즈로.
  5. 부드럽게 렌즈 섬유 세포 덩어리로 TD 버퍼를 주입 주사기 우울. 50 ~ 200 μL의 TD, 결코 300 개 이상의 μl를 주입한다. 상피 및 렌즈 캡슐에서 자신을 풀어 섬유 세포 질량을 관찰한다.
  6. 고정밀 집게를 사용하여, 전방 절개 부위를 통해 렌즈로부터 풀어 섬유 세포 덩어리를 제거한다.
    참고 :이 절차는이 사이트에 바로 인접한 섬유 세포가 부착 된 세포의 무 결함했다되는 후방 렌즈 기저막 캡슐 및 부상 렌즈 상피 세포를 떠난다.

3. Preparin전의 VIVO 문화 G 부상 렌즈

  1. 낭의 전방 측면에서 다섯 삭감하여, 배양 접시에 위에서 설명한 백내장 수술, 셀 사이드의 결과 렌즈 낭을 평평하게.
  2. 렌즈의 균분 원을 통해 절개 부위에 수직으로 잘라. 아래로 배양 접시 캡슐 측에 부착 된 상피 세포 쪽이 위로 렌즈 캡슐의 결과 다섯 "날개"를 평평하게. 스타 또는 flowerlike 모양 (그림 1B 참조)해야 지금 생체 부상 렌즈를합니다.
  3. 별의 각 지점에서 부드럽게 아래로 집게, 접시를 눌러 캡슐을 확보합니다. 이 이식편의 다섯 가장 바깥 끝에서 작은 들여 쓰기를하고 접시에 지속적인 첨부 파일에서 발생합니다.
    주 :이 절차 중에 캡슐 손상 가능하며 그래서 FLA의 선단에 가깝게 접시에 캡슐을 고정하는 것이 중요가능한 PS뿐만 아니라 가능한 확보 지점 최소량을 만들기 위해 (일반적으로 두 플랩 당 최대 세).
  4. 35mm 접시에서 TD 버퍼를 제거하고 미리 예열 미디어 1.5 ㎖로 교체합니다. 인큐베이터에서 뚜껑과 장소 35mm 접시 커버 (37 ° C를, 5 % CO 2).

후방 캡슐의 부상 영역의 재 상피화가 정량 분석​​을위한 렌즈 상피 세포의 원래 첨부 지대 (OAZ)에서 발생 중앙 마이그레이션 지대 (CMZ), 4. 분리.

참고 : 세포 손상에 대한 응답으로 즉시 CMZ 영역으로 이동하기 시작한다. 문화의 날 하나 충분한 세포는 미세 해부 (23)에 의해 CMZ와 OAZ의 분리 다음, 분자, 생화학 적 분석을 위해 CMZ를 통해 마이그레이션. 이 프로토콜은 캡슐의 상처 영역으로부터 한 번에 하나의 플랩 (OAZ)의 제거를 수반한다.

  1. demar을 준수양이온과 OAZ CMZ 사이, 해부 현미경 명확하게 볼 (도 2a 참조). 두 고정밀 집게를 사용하여, 라인의 양측에, OAZ / CMZ 라인에 바로 인접한 다른 하나의 에지에서 두 집게로 잡고 (도 2A, B, 화살표 참조).
  2. 한 손으로 / CMZ 측의 한 집게는 다른 손 / 집게로 부드럽게 OAZ / CMZ 라인을 따라 OAZ을 끌어 동안, 부상자 문화에 개최하는 것을 계속한다. CMZ 쉽게이 선을 따라 OAZ에서 분리합니다. 두 지역이 완전히 분리 될 때까지 전체 문화 주위에이 라인을 따라 계속합니다.
  3. 이러한 웨스턴 블롯 또는 공동 면역 (23, 25)와 같은 RNA-SEQ (24) 또는 생화학 적 분석과 같은 분자 분석을위한 분리 OAZ 및 CMZ 분수를 공부한다.

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결과

예 생체 내 모델은 세포의 기본 미세 환경에서 상처 치유 과정을 연구하기 위해 만들어

세포의 기본 미세 환경 내에서 상피의 상처 치유 조절에 관여하는 메커니즘을 조사하기 위해, 임상 적으로 생체 모의 백내장 수술 모델을 만들었습니다. 이 모델은 그의 고유 특성 때문에 많은 이점을 제공 렌즈 조직으로부터 생성된다 : 1) 렌즈 수정체 낭 불리는 두꺼운 기저막으로 둘러싸여 독립적 기관이다; 2)는 무 혈관성, 3)의 지배를하지 4) 관련 기질 무료입니다. 따라서, 검사 보수 프로세스가 적절한 렌즈 타고난 세포로 제한된다. 이 모델을 만들려면, 렌즈는 배아 (E) 하루 15 병아리 배아 (그림 1A)에서 제거됩니다. 작은 절개 렌즈 섬유 균체가 제거되는 전방 렌즈 캡슐과 연관된 렌즈 상피 세포에서 이루어진다하이드로 용출, 생리 학적으로 관련 상처 (그림 1A)를 생성하는 고전적인 백내장 절...

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토론

여기에서는 눈에서 제거한 후 병아리 배아 렌즈에 대해 생체 외 백내장 수술을 수행하는 상처 복구의 배양 모델을 준비하는 기술을 설명합니다. 수정체 상피는 생체 내에서 발생하는 것과 밀접하게 모방되는 복구 과정으로 이 임상적으로 관련된 상처에 반응하고 다른 상피 조직의 상처 복구와 특징을 공유합니다2,4. 프로토콜은 간단하고 따르기 쉽지만 배아 수정체로 모의 백내장 수술을 수행하려면 배아 수정체의 직경이 약 2mm에 불과하기 때문에 연습을 통해 습득할 수 있는 작은 조직을 다루는 기술을 개발해야 합니다. 백내장 수술 절차는 해부 현미경으로 수행되며, 중요한 기술 단계에는 전낭에 작은 절개를 하고, 수압 용출에 의해 섬유 세포 덩어리를 제거하고, 배양 연구를 위해 고정된 기질에 생 체 외 백내장 수술 후 수정체 조직을 평평하게 할 수 있도록 전방 상피를 추가로 절단하는 것이 포함됩니다. 미세 수술 백내장 수술 절차는 재현성이 높은 상처 부위를 생성하여 손상된 상피가...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화나트륨(NaCl)Fisher ScientificS271-3에서 140mM에서 사용
Fisher ScientificP217-500TD 버퍼
산나트륨(Na2HPO4)SigmaS0876)에서 0.7mM에서 사용
Fisher Scientific-포도당(덱스트로오스)D16-500TD 버퍼 트리스 베이스에서 0.5mM에서 사용
Fisher ScientificBP152-1TD 버퍼 염산에서 8.25mM에서 사용
Fisher ScientificA144-500TD 버퍼를 7.4로 pH 사용
Media 199GIBCO11150-059
L-글루타민Corning/CellGro25-005-CIMedia199
페니실린/스트렙토마이신Corning/에서 1%로 사용 CellGro30-002-CIMedia199
100mm 페트리 접시Fisher ScientificFB0875711Z
Stericup 필터 유닛MilliporeSCGPU01RE살균 여과에 사용
Dumont #5 겸자(2개 필요)Fine Science Tools11251-20
35mm 세포 배양 접시Corning430165
27G 1ml SlipTip 포함 정밀 글라이드 바늘BD309623
파인 가위파인 사이언스 도구14058-11
표준 펜치파인 사이언스 도구91100-12
기타 필요한 항목: 일반 해부 기구,  비옥한 흰 다리뿔 닭 알, 체크 알 인큐베이터 (가습, 37.7° C), 층류 후드, 쌍안 스테레오비전 해부 현미경
TD 버퍼 염화칼륨(KCl) 인 TD 버퍼 D-포도당(덱스트로오스 DFisher Scientific 에서 1%로 사용

참고문헌

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