전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
광학 해상도 및 투과 전자 현미경에서 특정 단백질 집단을 식별 도전 제한은 세포 생물학에서 장애물왔다. 많은 현상 시스템의 단순화 된 시험 관내 분석에 의해 설명과 완전하게 이해되기 위하여, 특히 1 nm 내지 0.1 ㎛의 범위 사이에, 반응계 내에서 추가 구성 정보를 필요로 할 수 없다. 여기서, 전자 분광 이미징, 단백질 및 핵산의 분포의 동시 맵핑을 허용 투과 전자 현미경 기법 및 식 태그 miniSOG은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리 병소의 구조 및 조직을 연구하기 위해 결합된다.
서론
최근 몇 년 동안 1 이상의 광학 현미경에서 상당한 발전에도 불구하고, 세포 생물 학자들은 여전히 해상도의 차이로 고통. 이 고분자 복합체 간의 상호 조정을 수반 기본적인 세포 과정의 구조 - 기능 관계의 이해를 제한 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링, DNA 수리, RNA의 전사 및 DNA 복제에). 투과형 전자 현미경 (TEM)이 필요한 해상도를 제공이야 있지만, 또한 시각 구조 생화학 적 조성물을 판별 할 수있는 동안 특정 단백질 라벨을 구조적으로 인해 무능력 이러한 프로세스를 정의하는 도전되었다. 핵 구조를 차별화하기 위해, 내부의 막 부재에있어서, 핵은 특히 도전왔다. 전자 분광 영상 (ESI)는 DNA, RNA, 및 PROT의 동시 검출 및 분화를 허용함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결핵 구조 2-5 EIN 기반.
전자 분광 영상 :
전자 현미경에서의 높은 감도 및 해상도의 원소 분포를 맵핑하기 위하여, 하나는 비탄 성적 시편 (6) 소자의 내부 쉘 전자와의 상호 작용을 통해 산란 된 전자를 선택 촬상 분광계를 사용할 수있다. 에너지의 원소가 특정 량의 시료 원자의 ....
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프로토콜
miniSOG 셀 라인의 1 세대
- 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된다 저 글루코스 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 2 ㎖를 함유하는 35mm 접시에 U2OS (인간 골육종) 세포 성장 분위기입니다.
- 그들은 miniSOG 및 mCherry위한 서열을 포함하는 플라스미드 작 제물이 형질 감염 시약 (19)의 제조자의 프로토콜에 따라 복구 단백질 태그 정제 형질 품질 (A269 / 280 비율 1.8 ~ 2.0)와 리포 펙션에 의해 80 % 컨 플루 언트가 될 때 세포를 형질 감염. miniSOG 발현 플라스미드는 첸 - 연구소에서 주문할 수 있습니다 : http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- 이틀 후 형질을 정렬 형광 활성화 셀 miniSOG과 mCherry 태그 재조합 단백질을 발현 정렬 세포. 세포를 수집20 과발현되는 셀을 방지하기 위해 중간 형광 강도.
- 배양 10 % FBS 및 G418 선택 에이전트 (네티) 0.6 μg의 / ㎖로 보충 된 DMEM 배지 10m....
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결과
ESI
종래의 TEM 이미지로 핵 (도 1)의 ESI 이미지를 비교 (예를 들어,도 7-1)은 쉽게 구별 될 수 해부학 적 구조에서 극적인 증가를 보여준다. 염색질 능선은 노란색으로 표시하고 마우스 세포에서 chromocenters를 확인하는 것은 매우 쉽습니다. 사전 조립 리보솜 이미 인이 풍부 RNA에 더하여, 질소 풍부 단백질의 다량을 함유 보낸 핵소체 쉽게 그들의 원형 구조와 다른 색으로 염색질 구별 될 수있다. 핵 및 핵 구멍 테두리에 얇은 층이 주변 염색질 인터럽트 질소가 풍부한 구조로 볼 수있는 바와 같이, 주변 염색질이 존재한다. 종종 박판 염색질은 주변의 외부 매우 얇은 청색 층으로 볼 수있다. 세포질에서, 인이 풍부 많은 작은 입자 수볼 수. 이들은 외부 핵 크기, 풍부와 위치에 따라 리보솜으로 식별 될 수있다. interchromati.......
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토론
ESI는 특별히 인이 풍부 영역을 매핑 할 수 있기 때문에 핵에서 염색질 및 리보의 여러 가지 상태를 조사하기위한 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 이는 근본적으로 전자 현미경에 의해 얻어진 비특이적 대조 방법에 의존하지 수 상세히의 양을 증대시킨다. ESI 하나의 단점은 동일한 가속 전압에서 TEM 종래보다 얇은 부분을 필요로한다는 것이다. 이것은 직렬 섹션 작업 또는 단층 (28)의 방법을 이용하여 극복 될 수있다.
많은 정보는, 인 및 질소의 분포를보고함으로써 얻어 질 수 있지만, 또한, 특정 단백질의 분포를 매핑 할 수있는 관심사이다. 상기 방법은 본 문서에 소개로, 그것은 ESI는 디아 미노 벤지딘의 부위 특이 적 중합에 기반 방법들과 결합 될 수 있음을 입증 하였다. 이 방법은 쿵푸를 추가하지 않지만ESI에 LL 새로운 색상, 그것은 단백질의 분포를 매핑 명확 유용하다. 이 염색질과 상호 작용하는 단백질에 특히 적용됩니다. 연구는 하나 이상의.......
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공개 사항
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감사의 글
miniSOG 구조를 제공해 주신 Roger Tsien 박사님께 감사드립니다. TEM에 도움을 주신 Xuejun Sun 박사님. Lisa Lem과 Peter Shipple은 산소를 공급해 준 Cross Cancer Institute의 연구원입니다. Hilmar Strickfaden은 Alberta Cancer Foundation에서 박사 후 연구원 과정을 밟고 있으며 Bayrische Forschungsallianz의 지원을 받았습니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research)와 앨버타 암 재단(Alberta Cancer Foundation)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
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| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 그리드 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek | P35G-2-14-CGRD | 몰입 목표를 위해 제작되지 않음 |
| LR White : 아크릴 수지 | emsdiasum | 14381 | |
| LR White 가속기 | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′ - 디아 미노 벤지딘 테트라 하이드로 클로라이드 10 mg 정제 | 시그마 | D5905 | |
| 슬림 바 그리드 300 메쉬 | SPI | 1161123 | |
| 텅스텐 포인트 랩 펜 | emsdiasum | 41148 | |
| 오스뮴 테트 록사이드 | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208, carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome, Leica EM, UC6 | Leica | ||
| Photoshop, CS5 | Adobe | 는 이전 버전에서도 작동할 수 있습니다 | |
| Digital Micrograph V.2.30 | , Gatan은 | 이전 버전에서도 작동할 수 있습니다 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
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| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| 세슘 137 방사선 소스 "마가복음 1장" | ( J.L. 셰퍼드 & Associated) | ||
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참고문헌
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein....
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